- Kết quả phân tích gen dystrophin của thai nhi:
4.3.3. Kết quả phân tích của các gia đình có mẹ mang gen bệnh
Hình 3.10 biểu hiện kết quả phân tích của gia đình bệnh nhân mã số 3. Bệnh nhân đã được xác định có đột biến mất đoạn các exon 42, 43 và exon 44. Phân tích hình ảnh điện di trên agarose và điện di định lượng của mẫu đối chứng nam và nữ, chúng ta thấy nồng độ các exon của đối chứng nam chỉ bằng 1/2 nồng độ exon tương ứng ở đối chứng nữ. Mặc khác, kết quả điện di của mẹ bệnh nhân cho thấy: nồng của hai exon không bị đột biến (exon 41, 46) bằng với nồng độ exon tương ứng ở chứng nữ. Đây là hai exon được sử dụng để làm đối chứng nội cho phản ứng PCR, với kết quả này chúng ta có thể khẳng định không có sự khác biệt về điều kiện thực hiện phản ứng PCR giữa các mẫu phân tích và kết quả phân tích hoàn toàn đáng tin cậy.
Với hai exon mà bệnh nhân bị đột biến mất đoạn (exon 42 và 43), đậm độ màu của chúng ở người mẹ nhạt hơn nhiều so với ở chứng nữ, và điều này biểu hiện rõ khi điện di trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer, độ cao của hai exon bị đột biến này ở người mẹ chỉ bằng 1/2 so với ở chứng nữ. Hwa (2007), cho rằng khi đỉnh của exon bị đột biến ở người mẹ bằng 1/2 so với chứng nữ thì người mẹ mang gen bị đột biến mất đoạn, nếu chiều cao exon bị đột biến ở người mẹ 1,5 lần so với chứng nữ thì người mẹ mang gen bị đột biến lặp đoạn gen [69]. Nghiên cứu của Lai cho rằng khi chiều cao đỉnh điện di mao quản của mẹ bệnh nhân giảm từ 35-50% so với chứng nữ thì người mẹ mang gen bị đột biến mất đoạn exon tương ứng với đỉnh điện di đó. Nếu chiều cao đỉnh điện di tăng từ 30-50% so với chứng nữ thì mẹ bệnh nhân mang gen bị đột biến lặp đoạn exon tương ứng [76]. Năm 2004, Joncourt nghiên cứu trên
44 thành viên nữ của 23 gia đình có bệnh nhân đột biến mất đoạn và đưa ra kết luận: nếu tỷ lệ giữa nồng độ của một exon nào đó ở thành viên nữ so với chứng nữ là 0,520,12 thì người nữ này bị đột biến mất đoạn exon đó [70].
Như vậy, chúng ta có thể kết luận: mẹ của bệnh nhân mã số 3 mang gen dystrophin bị đột biến mất đoạn từ exon 42 đến exon 44. Bởi vậy, khi khuếch đại hai exon 42 và 43 (nằm trong vùng bị mất đoạn) thì chỉ có 1 NST X bình thường của người mẹ chứa hai exon này được nhõn lên. NST X còn lại đã bị đột biến mất hai exon 42 và 43 nờn chỳng không được khuếch đại. Trong khi đó ở chứng nữ chứa hai NST X bình thường nên exon 42 và 43 nằm trên hai NST X của chứng nữ đều được khuếch đại, vì vậy nồng độ hai exon này ở chứng nữ gấp đôi so với ở người mẹ bệnh nhân.
Phân tích kết quả tương tự với gia đình bệnh nhân mã số 7 bị đột biến mất đoạn duy nhất exon 51. Tiến hành khuếch đại exon 51 cùng với hai exon bệnh nhân không bị đột biến là exon 13 và exon 41 nhằm làm đối chứng. Kết quả điện di agarose cho thấy đậm độ hai exon 13, exon 41 ở mẹ với đậm độ exon tương ứng ở chứng nữ, trong khi đậm độ exon 51 của mẹ nhạt hơn nhiều so với chứng nữ. Điều này gợi ý mẹ của bệnh nhân ở dạng dị hợp tử. Kết quả được khẳng định khi chúng tôi định lượng trờn mỏy điện di mao quản, nồng độ hai exon đối chứng (exon 13, 41) của mẹ bệnh nhân bằng với mẫu chứng nữ, nhưng nồng độ exon 51 (là exon bệnh nhân bị đột biến mất đoạn) của mẹ chỉ bằng ẵ so với đối chứng nữ. Từ đó, chúng tôi kết luận mẹ bệnh nhân là người mang gen bệnh.
Ở gia đình bệnh nhân mã số 7 còn có hai chị gái của bệnh nhân, kết quả phân tích cho thấy cả hai người chị gái đều mang gen bệnh. Như vậy bà mẹ của bệnh nhân mã số 7 đã truyền gen bệnh cho 100% các con hiện có của bà.
Kết quả này đưa ra lời cảnh báo, một người mẹ dị hợp tử có khả năng lan truyền gen bệnh với tỷ lệ khá cao, khá nhanh trong cộng đồng. Do vậy, việc phát hiện người mẹ mang gen đột biến để tiến hành chẩn đoán trước sinh, đưa ra lời khuyên di truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng là vấn đề cấp thiết hiện nay. Chỉ có như vậy mới làm giảm được tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh di truyền nói chung hay bệnh DMD nói riêng.
Gia đình thứ ba trong nhúm cỏc gia đình mang gen bệnh mà chúng tôi muốn phân tích là gia đình bệnh nhân mã số 11. Bệnh nhõn có đột biến mất đoạn gen từ exon 34 đến exon 43. Tiến hành khuếch đại bốn exon của bảy thành viên trong gia đình bệnh nhân gồm mẹ, cỏc dỡ và con gái của những người dì bệnh nhân. Trong bốn exon này, có hai exon mà bệnh nhân bị mất đoạn là exon 37, exon 41 và hai exon mà bệnh nhân không bị đột biến là exon 49 và 51.
Kết quả phân tích bằng hình ảnh điện di agarose và trờn máy Agilent 2100 Bioanalyzer cho thấy ở người mẹ bệnh nhân (mã số 11), người dì thứ nhất (mã số 13) và con gái của người dì này (mã số 17) có mang gen bị đột biến do đậm độ vạch điện di giảm và độ cao (tương ứng với nồng độ) của hai exon bị đột biến chỉ bằng 1/2 so với ở chứng nữ và ở các thành viên còn lại của gia đình. Trong khi đó, nồng độ hai exon không bị đột biến đồng đều nhau ở các thành viên trong gia đình và có giá trị bằng với ở chứng nữ.
Phõn tích phả hệ của gia đình chúng ta thấy bệnh nhân có 2 người cậu đã bị chết và được chẩn đoán là DMD. Người dì thứ nhất cũng đã sinh được 1 người con trai và vừa chết vì bệnh DMD. Điều đó chứng tỏ đó cú yếu tố di truyền trong gia đỡnh này. Như vậy, người mẹ và dì của bệnh nhân (mã số
13) là dị hợp tử bắt buộc và gen bệnh ở con trai của họ là do thừa hưởng từ mẹ. Tuy nhiên phân tích phả hệ chúng ta không thể xác định được người em họ của bệnh nhân (mã số 17) có mang gen bệnh hay không vì người em này còn nhỏ tuổi, chưa lập gia đình, xét nghiệm định lượng hoạt độ CK hoàn toàn bình thường. Tuy nhiên khi phân tích định lượng trờn máy Agilent 2100 Bioanalyzer cho thấy em bé có kiểu gen dị hợp tử. Kết quả khẳng định người dì của bệnh nhân (mã số 13) có mang gen đột biến và đã truyền gen bệnh cho người con trai (đã mất vì biến chứng suy hô hấp của DMD) và cho con gái của bà. Lời khuyên di truyền cho gia đình bệnh nhân đã được thực hiện, cần tiến hành chẩn đoán trước sinh khi người mẹ, người dì của bệnh nhận mang thai và khi người em gái họ của bệnh nhân (mã số 17) đến tuổi lập gia đình và chuẩn bị sinh con.
4.3.4. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh
Trong 48 thành viên nữ của 30 gia đình bệnh nhân có đột biến gen dystrophin, phát hiện được 21 người ở dạng dị hợp tử, chiếm tỷ lệ 43,8%. Trong đó gồm 15 người mẹ, 4 người chị em ruột của bệnh nhân, 1 người dì và 1 người em họ của bệnh nhân. Như vậy, có 50% bà mẹ bệnh nhân ở dạng dị hợp tử và 50% người mẹ hoàn toàn bình thường, có nghĩa là tỷ lệ đột biến mới phát sinh ở các bệnh nhân DMD trong nghiên cứu của chúng tôi là 50%. Theo Ligon, tỷ lệ bệnh nhân DMD thừa hưởng gen bệnh từ người mẹ là 2/3, chỉ có 1/3 trường hợp là do đột biến mới phát sinh [84]. Kết luận này tương tự như nghiên cứu của Gatta (2005) và Hung (2006) [55], [66].
Kết quả nghiên cứu chứng tỏ tỷ lệ đột biến mới phát sinh ở các bệnh nhân DMD Việt Nam tương đối cao, chiếm 50%. Điều này có thể được giải thích là do yếu tố chủng tộc, cũng có thể do các yếu tố bên ngoài tác động lên quá trình phát sinh giao tử ở cơ thể bố hoặc mẹ như điều kiện môi trường sống, do tập quán ăn uống, do chiến tranh đã để lại nhiều chất độc hại trong môi trường,... Theo Fortina, Mukherjee và nhiều tác giả, đột biến mới phát sinh gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thường xảy ra trong quá trình tạo giao tử do tác động của các yếu tố bên ngoài [2], [52], [72], [97].
Đây là nghiên cứu xác định người lành mang gen dystrophin đột biến đầu tiên được thực hiện ở Việt Nam. Nghiờn cứu đóng vai trò rất quan trọng vì hầu hết các thành viên nữ mang gen bệnh vẫn còn đang ở lứa tuổi sinh đẻ, kết quả này là cơ sở giúp chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền.