- Nhóm nghiên cứu:
2.3.3. Quy trỡnh tách chiết RNA tổng số từ máu ngoại
- Máu tươi chống đông EDTA được tách trong vòng 24 giờ.
- Tách tế bào bạch cầu trong môi trường Mono-polyresolving: Cho 7ml dung dịch Mono-polyresolving vào ống nghiệm, cho tiếp vào ống nghiệm 7ml máu tươi toàn phần, không được lắc.
- Quay ly tâm 2600 v/p ở 4°C hoặc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Hút phần cặn lắng chứa tế bào bạch cầu, rửa tế bào bạch cầu bằng nước muối sinh lý 0.5%.
- Cho 1ml dung dịch isogen vào phần tế bào bạch cầu vừa thu được, isogen có tác dụng phá vỡ màng tế bào, giải phóng ra acid nucleic.
- Dịch thu được cho vào ống Eppendorf để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm 15.000 v/p ở 4°C trong 10 phút.
- Sau ly tâm, hút lấy phần dịch ở giữa ống, loại bỏ phần trên cùng là lớp lipid, và phần cặn xác tế bào ở đáy ống.
- Cho 200μl chloroform vào phần dịch giữa, lắc nhẹ trong 15 giây, tủa DNA xuất hiện, để ở nhiệt độ phòng 2-3 phút.
- Ly tâm 15.000 v/p ở 4°C trong 15 phút. Dịch sau ly tâm được chia làm 3 lớp:
+ Lớp giữa chứa DNA + Lớp dưới chứa protein
- Dùng pipet hút phần dịch trên cùng và chuyển sang ống Eppendorf sạch. Thêm 500μl isopropanol và lắc nhẹ, tủa RNA sẽ xuất hiện, để 5-10 phút ở nhiệt độ phòng.
- ly tâm 15.000 v/p ở 4°C trong 5 phút. Sau ly tâm, RNA tổng số nằm ở đáy ống. Gạn bỏ phần dung dịch, giữ lại phần cặn lắng.
- Rửa cặn bằng 1000μl dung dịch ethanol 75%, tiếp tục ly tâm 10.000 v/p ở 4°C trong 5 phút.
- Loại bỏ phần dung dịch, giữ lại phần cặn lắng, mở nắp ống để khô tự nhiên, phần cặn chính là RNA tổng số đã được rửa sạch.
- Hòa tan cặn bằng 20μl nước cất có DEPC (DEPC-water). Lắc nhẹ cho cặn tan, dung dịch thu được là dung dịch RNA tổng số, cất giữ ở -70°C.
Sau khi tách chiết, kiểm tra độ tinh sạch của RNA bằng phương pháp đo mật độ quang.
Tách chiết RNA là khâu quan trọng nhất đảm bảo cho sự thành công của giai đoạn tiếp theo tổng hợp chuỗi DNA bổ sung (cDNA).