- Kết quả phân tích gen dystrophin của thai nhi:
4.1. Quy trình tách chiết DNA, RNA và tổng hợp phân tử cDNA
Việc phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi hai nhà bác học Watson và Crick vào năm 1953 chính thức đánh dấu sự ra đời của Sinh học phân tử. Kể từ đó đến nay, SHPT phát triển không ngừng về cả lý thuyết và thực tiễn. Trong lĩnh vực y học, các kỹ thuật SHPT ngày càng hoàn thiện giúp chẩn đoán nhiều bệnh lý di truyền và ung thư. Muốn áp dụng được các kỹ thuật SHPT để phát hiện đột biến gen, giai đoạn đầu tiên cần phải làm là tách chiết RNA, DNA. Quỏ trình tách chiết RNA, DNA là một trong những khâu quan trọng nhất giúp chẩn đoán các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh DMD nói riêng. Nếu các phân tử acid nucleic được tách tốt, không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm thỡ cỏc phản ứng tiếp theo mới có độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này, chỳng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo quy trình phenol/chloroform. Đầu tiên, sử dụng dung dịch Lysis buffer để tách bạch cầu ra khỏi hồng cầu. Tiếp theo, thêm vào dung dịch K (có nồng độ muối thấp) để phá vỡ màng tế bào bạch cầu, giải phóng ra RNA và DNA. Tiến hành loại bỏ các protein và các tạp chất khác bằng cách sử dụng dung dịch lysis buffer, protease K và hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl. Hóa chất phenol sẽ gây biến tính protein còn chloroform tác dụng phân hủy lipid. Sau đó, tiến hành loại bỏ phenol còn sót lại trong mẫu để tránh hiện tượng ức chế hoạt động của các enzym trong các thí nghiệm tiếp theo. Quy trình gồm nhiều phản ứng liên tiếp, có những phản ứng được lặp lại nhiều lần để loại bỏ hết những chất không cần thiết giúp sản phẩm có độ tinh sạch cao. Theo Adeli
(1990), quy trình phenol/chloroform mất nhiều thời gian và công sức, tuy nhiên các phân tử DNA thu được có độ tinh sạch rất cao [25]. Điều này được khẳng định khi chúng tôi tiến hành đo độ tinh sạch của các phân tử DNA, tỷ lệ mật độ quang của các mẫu DNA ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong khoảng 1,8-2,0.
So với quá trình tách chiết DNA, quy trình tách chiết RNA phức tạp hơn. Sau khi lấy máu, cần tiến hành tách chiết RNA tổng số càng sớm càng tốt, thông thường là phải tách RNA trong vòng 24 giờ sau khi lấy máu. Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzym ribonuclease (RNase). Các enzym RNase tồn tại ở khắp nơi, có hoạt tính rất cao và bền vững với cỏc tỏc nhân thường dùng để loại bỏ enzym (việc xử lý nhiệt ở 90o
C trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vỡ cỏc lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần không mang găng,…
Chỳng tụi đó thử nghiệm tách chiết RNA tổng số theo nhiều quy trình và cuối cùng đã chọn lựa được phương pháp hiệu quả, tách được phân tử mRNA có chất lượng cao. Đó là phương pháp sử dụng isogen như đã trình bày ở mục 2.3.3. Năm 2006, Tay tiến hành chẩn đoán đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD thuộc vùng Đông Nam Á. Tác giả này đó tách chiết phân tử mRNA của bệnh nhân theo quy trình như nghiên cứu chúng tôi sử dụng và đã thu được phân tử các phân tử mRNA có chất lượng tốt [129]. Trong nghiên cứu này, sau khi tách được RNA tổng số, chúng tôi xác định độ tinh sạch của phân tử RNA bằng các chỉ số hấp thụ quang phổ, dựa vào tỉ lệ
A260/A280. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu RNA cho phép xác định nồng độ RNA trong dung dịch. Protein có độ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm (A280) và độ hấp thụ thấp ở bước sóng 260 nm. Do vậy, tỉ lệ A260/A280 biểu thị mức độ protein còn sót lại trong dịch chiết. RNA được coi là tinh sạch khi giá trị A260/A280 = 1,8-2,0 [18]. Như vậy, có thể khẳng định rằng quy trình tách RNA tổng số của chúng tôi là quy trình chuẩn hiện nay và có thể sử dụng dịch chiết RNA để tổng hợp cDNA cho các phản ứng tiếp theo.
Quá trình tổng hợp cDNA dựa trên mẫu khuôn là mRNA được thực hiện bởi enzym sao mã ngược. Qua nhiều lần thí nghiệm, chúng tôi đã đưa ra quy trình chuẩn để tổng hợp phân tử cDNA của nhóm đối chứng bình thường cũng như các bệnh nhân DMD trong điều kiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Trung tõm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Sau mỗi lần tổng hợp cDNA, chúng tôi kiểm tra chất lượng sản phẩm bằng phản ứng khuếch đại đoạn gen GADPH với cặp mồi đặc hiệu. Gen GADPH hiện diện ở mọi tế bào của cơ thể và được xem như là gen nội chuẩn được sử dụng để kiểm tra chất lượng của DNA nói chung hay cDNA nói riêng. Sau phản ứng khuếch đại, nếu chất lượng cDNA không tốt, bị đứt gãy hay tạp nhiễm thì băng điện di trên agarose sẽ mờ, bờ không đều, loang lổ, xuất hiện các băng phụ [127], [132]. Đối với nghiên cứu của chúng tôi, sau khi khuếch đại phân tử cDNA bằng cặp mồi GADPH, kết quả điện di agarose luôn xuất hiện những băng sáng, bờ đều, không có băng phụ (hình 3.1). Như vậy, có thể chứng minh rằng quy trình tổng hợp cDNA chuẩn hóa ở trên là tối ưu và phân tử cDNA tổng hợp được đáng tin cậy để tiến hành các phản ứng nested PCR nhằm xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA.