- Nhóm nghiên cứu:
2.3.4.Quy trình RT-PCR tổng hợp cDNA
* Tổng hợp cDNA sử dụng phương pháp MMLV-RT:
Những mẫu RNA đạt được nồng độ tối ưu và có độ tinh sạch dao động 1,8-2,0 sẽ được sử dụng để tổng hợp cDNA.
Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation).
- Sử dụng 2-3 μg RNA tổng số, thêm nước khử DEPC cho đủ 6 l/1 ống. - Để ở nhiệt độ 65oC trong vòng 5 phút để biến tính chuỗi RNA.
Bước 2: Giai đoạn gắn mồi (annealing).
- Thêm vào 2μl Random primer (đã được pha loãng 20 lần). - dNTP 10mM: 5μl.
- Để ở nhiệt độ 25°C trong 10 phút, để primer gắn với RNA khuôn, sau đó để vào đá lạnh 1 phút.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp cDNA (extention).
- Tiếp tục cho thêm:
+ PCR buffer 5X: 4μl
+ DTT 0,1M (ức chế enzym proteinase: 1μl
+ HPRI (ức chế enzym RNAase): 1μl
+ MMLV – RT (enzym reverse transcriptase): 1μl - Tổng thể tích của phản ứng: 20μl
- Trộn đều dung dịch bằng pipet, đưa vào ly tâm thật nhanh khoảng 10- 15 giây để kéo toàn bộ dung dịch xuống.
- Đưa vào máy PCR, đặt chương trình tổng hợp với nhiệt độ và thời gian như sau:
+ 37°C trong 55 phút + 70°C trong 15 phút + 4°C bảo quản tạm thời
- cDNA sẽ được cất giữ ở tủ lạnh -20°C cho đến khi đem ra sử dụng.
* Kiểm tra chất lượng cDNA được tổng hợp:
Kiểm tra chất lượng cDNA bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với GADPH. Cặp mồi đặc hiệu với GADPH có trình tự nucleotid như sau:
Mồi xuôi GAPDH: 5’ - ACA TGT TCC AAT ATG ATT CC - 3’
-Thành phần của phản ứng khuếch đại gen nội chuẩn GADPH:
Thành phần Thể tích (μl)
10 x buffer 2,0
2,5 mM dNTP 2,0
Taq polymerase (Takara, Japan) 0,2
10 pmol mồi xuôi 1,0
10 pmol mồi ngược 1,0
cDNA 2,0 Nước cất 11,8 Tổng số 20 -Chu trình nhiệt: 940C/5phút 940C/30giây 580C/20giây 720C/20giây 35 CK 720C/5phút 40C/ 940C/5phút 940C/30giây 580C/20giây 720C/20giây 35 CK 720C/5phút 40C/
- Kết quả được điện di trên gel agarose 1,5%.