- Kết quả phân tích gen dystrophin của thai nhi:
4.2.1.Phản ứng nested-PCR xác định đột biến mất đoạn ge nở mức độ mRNA
Sau khi thu được phân tử cDNA có chất lượng tốt, chúng tôi sử dụng phản ứng nested PCR với 15 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn gen mang thông tin di truyền. Trong đó, có 5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 là 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B và 10 cặp mồi còn lại sử dụng cho phản ứng PCR lần 2. Mỗi cặp mồi sẽ khuếch đại một đoạn gen dystrophin và kích thước đoạn gen được khuếch đại bởi cặp mồi tương ứng được mô tả ở hình 2.1. Sản phẩm PCR lần 2 có thể tích là 20 μl, tiến hành điện di 10 μl trên gel agarose 1,5%. Kết quả của bệnh nhân được so sánh với mẫu đối chứng, hoặc so sánh với kích thước đoạn DNA mà cặp mồi khuếch đại được ở người bình thường theo lý thuyết (hình 2.1).
Kết quả hình 3.2 thể hiện hình ảnh phân tích của bệnh nhân mã số 23. Khi tiến hành phản ứng PCR lần 2 với cặp mồi 1C-1D, sản phẩm PCR thu được ở mẫu đối chứng có kích thước khoảng 1230 bp. Kích thước này phù hợp với lý thuyết là cặp mồi 1C-1D cho phép khuếch đại đoạn gen dystrophin từ exon 1 đến exon 11, đoạn gen này có kích thước khoảng 1229 bp (hình 2.1). Sản phẩm PCR thu được của bệnh nhân chỉ có kích thước khoảng 600 bp. Theo nghiên cứu của Robert (1991), Trần Võn Khỏnh (2005), khi khuếch đại một đoạn gen từ khuôn mẫu là cDNA, nếu sản phẩm thu được từ mẫu nghiên cứu của bệnh nhân có kích thước nhỏ hơn so với mẫu đối chứng thì bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen. Đột biến này làm cho đoạn gen bị ngắn đi, do vậy khi điện di trên agarose, vạch của sản phẩm khuếch đại ở bệnh nhân này sẽ di chuyển xa hơn so với vạch sản phẩm khuếch đại từ mẫu đối chứng không có đột biến gen [9], [112]. Năm 2006, Tay đã phân tích gen
dystrophin của 14 bệnh nhân DMD ở mức độ mRNA và đưa ra kết luận tương tự như Robert và Trần Võn Khỏnh [129].
Sản phẩm PCR lần 2 của bệnh nhân mã số 23 có kích thước nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại từ mẫu đối chứng (600 bp so với 1230 bp), chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gen nằm trong khoảng từ exon 1-11. Tuy nhiên, với phản ứng nested PCR chúng ta không thể biết chính xác vị trí exon bị đột biến mất đoạn. Do vậy phải tiến hành nhân dòng đoạn gen bị đột biến của bệnh nhân, tách DNA plasmid để giải trình tự nhằm xác định vị trí bị đột biến. Kết quả giải trình tự gen cho thấy đầu 3’ của exon 2 (TCTAAG) gắn trực tiếp với đầu 5’ của exon 8 (ATGTTG) (hình 3.2) và đoạn exon từ 3 đến 7 của bệnh nhân (có kích thước khoảng 630 bp) đã bị xóa đoạn hoàn toàn. Như vậy, có thể kết luận rằng bệnh nhân mã số 23 đã bị đột biến mất đoạn gen từ exon 3 đến exon 7. Đột biến này làm lệch khung dịch mã trong quá trình tổng hợp protein dystrophin và gây bệnh DMD ở bệnh nhân.
Với bệnh nhân mã số 26, ở phản ứng nested PCR lần thứ nhất, sử dụng cặp mồi 1A-1B cho phản ứng PCR lần 1 và sau đó tiến hành hai phản ứng PCR lần 2 với hai cặp mồi 1C-1D và 1E-1F. Kết quả điện di cho thấy đoạn DNA thu được của mẫu đối chứng và của bệnh nhõn cú kích thước bằng nhau chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn trong vùng gen được khuếch đại bởi hai cặp mồi 1CD và 1EF. Tiến hành các phản ứng nested- PCR tiếp theo với hai phản ứng PCR lần 1 được thực hiện với cặp mồi 2A-2B và 3A-3B. Sau đó sử dụng sản phẩm khuếch đại lần 1 bởi hai cặp mồi 2AB và 3AB để tiến hành bốn phản ứng PCR lần 2 bằng cách sử dụng bốn cặp mồi tương ứng lần lượt là 2C-2D, 2E-2F, 3C-3D và 3E-3F. Kết quả cho thấy: với các cặp mồi 2CD, 2EF, 3CD thì sản phẩm PCR thu
được của bệnh nhân có kích thước bằng với đoạn DNA của mẫu đối chứng. Tuy nhiên, với cặp mồi 3E-3F, cho phép khuếch đại đoạn gen dystrophin từ exon 36 đến exon 45, sản phẩm PCR thu được của bệnh nhân có kích thước nhỏ hơn so với mẫu đối chứng (750 bp so với 1450 bp). Như vậy, chắc chắn bệnh nhân đã bị đột biến mất đoạn gen nằm trong khoảng exon 36 đến 45. Kết quả giải trình tự gen cho thấy đầu 3’ của exon 39 (GGAAAG) nối trực tiếp với đầu 5’ của exon 44 (GCGATT) và chúng tôi khẳng định bệnh nhân đã bị đột biến mất đoạn từ exon 40 đến exon 43.
Chỉ với 9 phản ứng PCR gồm 3 phản ứng lần 1 và 6 phản ứng lần 2 đã phát hiện được bệnh nhân mã số 26 có đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA. Sau đó, bằng phương pháp giải trình tự, vị trớ các exon đột biến đã được xác định. Trong khi đó, nếu muốn phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin của bệnh nhân ở mức độ DNA thì phải khuếch đại dần dần từng exon, bắt đầu từ vị trí exon thứ nhất và để phát hiện được đoạn exon 40- 43 bị mất đoạn ở bệnh nhân, nếu tiến hành phản ứng với từng cặp mồi riêng lẻ, chúng ta phải sử dụng ít nhất 44 cặp mồi tương ứng với 44 phản ứng PCR để khuếch đại dần từng exon từ 1 đến 44. Ngoài ra, cần phải điện di trên agarose 44 lần để xác định vạch DNA tương ứng có xuất hiện hay không. Quỏ trình được tiến hành song song với 44 lần PCR của mẫu đối chứng. Điều này gõy tốn kém nhiều về thời gian, công sức lẫn hóa chất. Qua đó, chúng ta có thể khẳng định ưu điểm của việc xác định đột biến xóa đoạn ở mức độ mRNA so với mức độ DNA. Với ưu điểm này, hiện nay, Tay và Lai đã sử dụng phương pháp RT-PCR để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD ở Singapore [129].
Sử dụng kỹ thuật khuếch đại cDNA với bệnh nhân mã số 45. Tiến hành phản ứng nested PCR lần thứ nhất và thứ hai với việc sử dụng hai cặp mồi 1AB và 2AB cho hai phản ứng PCR lần 1, sau đó thực hiện các phản ứng PCR lần 2 với bốn cặp mồi tương ứng là 1CD, 1EF, 2CD và 2EF. Kết quả điện di ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm PCR lần 2 của bệnh nhân luụn cú kích thước bằng với mẫu đối chứng. Tiếp tục tiến hành phản ứng nested PCR lần thứ 3 với cặp mồi 3AB cho PCR lần 1 và phản ứng PCR lần 2 với 2 cặp mồi 3CD, 3EF. Kết quả ở mẫu đối chứng xuất hiện vạch đúng với kích thước đoạn DNA mà 2 cặp mồi này khuếch đại được ở người bình thường không có đột biến mất đoạn gen dystrophin (khoảng 1050 bp đối với cặp mồi 3CD và 1450 bp đối với cặp mồi 3EF). Trong khi đó, ở bệnh nhân không xuất hiện vạch khi điện di. Nguyên nhân được nghĩ đến là do ở bệnh nhân, vị trí gắn của các cặp mồi đã bị đột biến.
Trên cơ sở sẵn có sản phẩm PCR lần 1 được khuếch đại với cặp mồi 3AB, tiến hành phản ứng lần 2 với cặp mồi 3C-3F (khuếch đại đoạn gen từ exon 31 đến 45), sau đó điện di sản phẩm PCR của bệnh nhân và mẫu đối chứng. Đoạn DNA của mẫu đối chứng có kích thước khoảng 2200 bp, trong khi đoạn DNA thu được của bệnh nhân chỉ có kích thước khoảng 650 bp. Tiến hành giải trình tự đoạn gen này của bệnh nhân, đoạn gen dystrophin từ exon 35 đến exon 43 của bệnh nhân bị xóa đoạn hoàn toàn. Trong bảng thiết kế 15 cặp mồi cho các phản ứng nested PCR (hình 2.1), vị trí gắn của mồi 3D (mồi ngược) là đầu 3’ của exon 38, còn vị trí gắn của mồi 3E (mồi xuôi) là đầu 5’ của exon 36. Bệnh nhân mã số 45 bị đột biến mất đoạn từ exon 35 đến exon 43, có nghĩa là hai mồi 3D và 3E không còn vị trí để gắn. Bởi vậy, khi sử dụng 2 cặp mồi 3CD và 3EF để khuếch đại đoạn gen dystrophin của bệnh
nhân thì không tồn tại sản phẩm đặc hiệu của hai cặp mồi này, do đó không xuất hiện vạch khi điện di trên agarose.
Phân tích quá trình xác định đột biến của bệnh nhân mã số 45, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp RT-PCR với 10 cặp mồi sử dụng cho 10 phản ứng PCR và phát hiện bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 35-43. Trong khi đó nếu phát hiện đột biến ở mức độ DNA phải sử dụng ít nhất 44 cặp mồi để khuếch các exon từ 1 đến exon 44 thì mới xác định được vị trí đột biến của bệnh nhân. Điều này một lần nữa cho thấy ưu điểm của việc xác định đột biến ở mức độ mRNA so với mức độ DNA.
Với các bệnh nhân không có đột biến mất đoạn gen dystrophin, ví dụ bệnh nhân mã số 24, chúng tôi đã sử dụng 5 cặp mồi cho các phản ứng PCR lần 1 và 10 cặp mồi cho 10 phản ứng PCR lần 2 để khuếch đại toàn bộ chiều dài gen dystrophin (bao gồm 79 exon) của bệnh nhân và mẫu đối chứng. Sau mỗi phản ứng PCR lần 2, sản phẩm PCR được điện di trên agarose. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm DNA thu được sau mỗi phản ứng của bệnh nhân và mẫu đối chứng luụn cú kích thước bằng nhau (hình 3.5). Như vậy, bệnh nhân mã số 24 không có đột biến mất đoạn gen dystrophin. Những nghiờn cứu của Robert và Tay cho rằng, với các bệnh nhân DMD bị đột biến điểm hoặc đột biến nhỏ, khi tiến hành khuếch đại cDNA của bệnh nhân thì sản phẩm PCR của bệnh nhân cũng có kích thước bằng với mẫu đối chứng, tuy nhiên đoạn gen chứa điểm đột biến không có chức năng hoặc giảm chức năng tổng hợp protein dystrophin. Chỉ bằng phương pháp giải trình tự chúng ta mới xác định được dạng đột biến điểm [112], [129]. Trên cơ sở đó cú 10 đoạn cDNA (là các sản phẩm PCR lần 2) chứa 79 exon của gen dystrophin, có thể giải trình
tự từng đoạn cDNA để xác định điểm đột biến. Trong nghiên cứu của Robert và Tay, các tác giả đó dùng 10 đoạn cDNA của bệnh nhân không xác định được đột biến mất đoạn để tiếp tục tiến hành phản ứng Protein Truncation Test (PTT) nhằm dũ tìm đoạn gen chứa điểm đột biến, sau đó chỉ tiến hành giải trình tự duy nhất đoạn gen nghi ngờ để xác định vị trí nucleotid bị đột biến trên gen dystrophin. Trong nghiên cứu chúng tôi, vì lý do tài chớnh nên chúng tôi chưa tiếp tục xác định các dạng đột biến điểm, đột biến nhỏ và đột biến lặp đoạn ở bệnh nhân mã số 24 (cũng như các bệnh nhân chưa xác định được đột biến mất đoạn khác). Tuy nhiên, 10 đoạn cDNA của từng bệnh nhân vẫn được lưu giữ ở tủ lạnh -20°C và có thể được phân tích khi có điều kiện.