- Kết quả phân tích gen dystrophin của thai nhi:
4.3.6. Kết quả định lượng hoạt độ enzym CK
Bảng 3.7 mô tả hoạt độ enzym CK của 48 thành viên nữ của 30 gia đình bệnh nhõn cú đột biến gen. Nghiên cứu cho thấy 18 thành viên có hoạt độ CK tăng hơn 2 lần giới hạn trên của trị số bình thường. Trong đó có 14 người được xác định có mang gen đột biến và 4 người không mang gen bệnh. Như vậy, trong 21 người nữ dị hợp tử, 66,7% trường hợp có hoạt độ CK máu tăng cao. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Norman và Sibert: khoảng 2/3 người nữ dị hợp tử bắt buộc có hoạt độ CK máu tăng cao [99], [118]. Nghiên cứu của Passor cũng cho kết quả tương tự [102].
Nghiên cứu cho thấy trong 28 thành viên nữ không mang gen bệnh, có 4 thành viên có hoạt độ CK máu tăng cao, chiếm 14,8%. Theo Hutton và
Sibert, định lượng hoạt độ CK chỉ thật sự chính xác khi bệnh nhân không hoạt động thể lực trong vòng 48 giờ trước khi lấy máu. Khi bệnh nhân làm việc nặng, hoạt độ CK máu tăng rất cao [68], [118]. Các thành viên nữ của chúng tôi chủ yếu là nông dân, việc ngưng lao động trong vòng 48 giờ khó kiểm soát được. Hơn nữa, các thành viên được lấy máu tại Bệnh viện Nhi Trung Ương nhưng phần lớn gia đình của họ ở rất xa Hà Nội, việc đi lại vất vả có thể ảnh hưởng đến hoạt độ CK máu. Ngoài ra, theo Meltzer, hoạt độ CK máu được kiểm soát bởi hệ thống di truyền độc lập. Khi nghiên cứu trên quần thể người bình thường ông nhận thấy, có những gia đình có hoạt độ CK máu rất cao nhưng một số gia đình lại có hoạt độ CK máu thấp [95]. Vì vậy, các nhà khoa học khuyến khích không sử dụng hoạt độ CK máu đơn thuần để chẩn đoán người lành mang bệnh mà phải phối hợp với phân tích phả hệ hoặc phân tích gen [95], [123]. Nghiờn cứu của Prior (2005) cho rằng có đến 40-50% người nữ dị hợp tử có hoạt độ CK bình thường [107].
Hiện nay, với sự phát triển của sinh học phân tử, có rất nhiều kỹ thuật hiện đại giúp chẩn đoán dị hợp tử như phương pháp PCR định lượng, Southern blot, MLPA, FISH,… Do vậy, các tác giả hạn chế sử dụng phương pháp định lượng hoạt độ CK máu để xác định người lành mang gen bệnh [66], [88].
4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD
Việc phát hiện người lành mang gen bệnh là cơ sở quan trọng để tiến hành chẩn đoán trước sinh nhằm tầm soát các thai nhi mắc bệnh. Hiện nay ở Việt Nam, phương thức lấy mẫu trong chẩn đoán trước sinh các bệnh lý di truyền chủ yếu là chọc hút dịch ối và sinh thiết nhung mao màng nuôi. Cả hai phương pháp lấy mẫu này đều ảnh hưởng đến sự an toàn của thai nhi
cũng như cho mẹ, có thể gây ra biến chứng sẩy thai, rỉ ối, thai chết lưu,…[120], [123]. Do vậy, vấn đề sàng lọc trước sinh luôn được các nhà khoa học tiến hành.
Có ba yếu tố giúp sàng lọc các thai phụ tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh DMD là phân tích phả hệ, định lượng hoạt độ enzym CK huyết thanh mẹ và xác định người mẹ dị hợp tử bằng các kỹ thuật SHPT [123]. Trong các yếu tố sàng lọc này thì việc chẩn đoán xác định thai phụ có mang gen đột biến hay không là yếu tố quan trọng nhất. Nếu người mẹ có kiểu gen dị hợp tử thì bắt buộc phải tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để chẩn đoán di truyền cho dù nguy cơ xảy ra tai biến đã được xác định [122], [124]. Ngược lại, nếu thai phụ không mang gen thì phải khuyên gia đình không nên tiến hành chẩn đoán trước sinh theo phương pháp lấy mẫu xâm phạm thai.
Trong 21 người nữ được chúng tôi phát hiện có kiểu gen dị hợp tử, có hai thành viên tiếp tục mang thai, đây là hai người mẹ của bệnh nhân mã số 20 (đột biến mất đoạn gen từ exon 3-8) và bệnh nhân mã số 39 (đột biến mất đoạn exon 46-50). Hai thai phụ được tư vấn phải tiến hành chẩn đoán trước sinh. Chọc hút dịch ối được tiến hành vào tuần lễ thứ 14 (đối với mẹ bệnh nhân mã số 20) và vào tuần lễ thứ 16 (cho mẹ bệnh nhân mã số 39). Sau đó, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào ối trong vòng 1 tuần. Ngoài mục đích làm tăng số lượng tế bào thai nhi thu thập được, nuôi cấy tế bào ối cũn giỳp loại bỏ các tế bào máu mẹ lẫn vào mẫu bệnh phẩm của thai nhi. Sau khi thu hoạch tế bào nuôi cấy, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của tế bào thai nhi theo phương pháp phenol/chloroform để tiến hành phân tích di truyền.
Đặc điểm di truyền của bệnh DMD là di truyền lặn liên kết NST giới tính X mà không có allen tương ứng trên NST Y. Do vậy, người nam chỉ cần
nhận một NST X bị bệnh từ người mẹ thì sẽ bị bệnh DMD. Trong khi đó người nữ phải nhận cả hai NST X đột biến, một từ bố và một từ mẹ thì mới có thể biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, bệnh nhân nam DMD thường tử vong trước tuổi lập gia đình, do vậy khả năng người nam truyền bệnh cho con gái không thể xảy ra. Bởi vậy, trên lâm sàng chúng ta thường gặp bệnh nhân DMD là nam mà hiếm khi gặp bệnh này ở trẻ em nữ. Xác định giới tính của thai nhi là bước đầu tiên cần thực hiện sau quá trình tách chiết DNA của mẫu tế bào ối thai nhi. Sử dụng cặp mồi cho phép khuếch đại đoạn gen xác định giới tính
SRY nằm trên NST Y, trình tự nucleotid của cặp mồi được chọn tương tự như nghiên cứu của Hussey [67]. Phản ứng PCR được tiến hành với mẫu DNA của thai nhi, kèm theo các chứng nam, chứng nữ và DNA của bệnh nhân DMD (là anh trai của thai nhi). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose nồng độ 1,5%. Xác định giới tính của thai nhi dựa vào sự xuất hiện vạch điện di đặc hiệu có kích thước 254 bp, hoặc so sánh với mẫu đối chứng nam. Mỗi mẫu DNA thai nhi, chúng tôi lặp lại phản ứng 3 lần để tránh sự nhầm lẫn.
Với mẫu DNA thai nhi của gia đình bệnh nhân mã số 20, kết quả điện di cho thấy xuất hiện vạch có kích thước bằng với vạch của mẫu đối chứng nam và của anh trai bệnh nhân, kích thước đoạn DNA này khoảng 254 bp. Trong khi đó mẫu đối chứng âm (nước) và đối chứng nữ không xuất hiện vạch của DNA tương ứng. Điều này chứng tỏ có sự hiện diện của NST Y trong tế bào thai nhi và chúng tôi khẳng định giới tính của thai nhi là nam. Theo các tác giả, người mẹ dị hợp tử có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ [34]. Như vậy, khả năng mắc bệnh DMD của thai nhi ở gia đình mã số 20 là rất cao, với tần suất là 50%.
Trên cơ sở biết được vị trí đột biến của anh trai thai nhi cũng như của người mẹ là mất đoạn gen dystrophin từ exon 3-8, tiến hành phân tích đoạn gen dystrophin từ exon 2 đến exon 9 của thai nhi bằng phản ứng PCR. Kết quả điện di ở hình 3.17 cho thấy, đối với exon 2, vạch điện di xuất hiện ở tất cả các mẫu phân tích (trừ mẫu chứng âm) là mẫu đối chứng dương, mẫu tế bào ối và mẫu bệnh nhân. Nhưng với cặp mồi khuếch đại exon 3, vạch DNA tương ứng chỉ xuất hiện ở mẫu chứng dương và mẫu DNA thai nhi mà không xuất hiện ở bệnh nhân. Điều này là phù hợp vì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 3 nên sẽ không xuất hiện vạch DNA tương ứng với exon 3. Kết quả này chỉ ra rằng, thai nhi không bị đột biến mất đoạn exon 3. Tiến hành tương tự với các exon từ 4 đến 8 chúng tôi đưa ra kết luận, thai nhi nam hoàn toàn bình thường, không mang gen đột biến và gia đình được khuyên giữ thai. Hiện nay, thai nhi được 8 tháng và chắc chắn sau khi sinh, em bé sẽ được lấy máu, tách chiết DNA để khẳng định chẩn đoán.
Gia đình thứ hai tham gia chẩn đoán trước sinh là gia đình của bệnh nhân mã số 39. Sau khi tách DNA tế bào ối, tiến hành xác định giới tính của thai nhi. Kết quả điện di cho thấy: ở mẫu đối chứng nam và mẫu bệnh nhân (anh trai của thai nhi) xuất hiện đoạn DNA có kích thước 254 bp. Trong khi đó mẫu đối chứng nữ và mẫu DNA thai nhi không xuất hiện vạch tương ứng. Kết quả này chứng tỏ thai nhi là nữ. Khả năng thai nhi mắc bệnh là rất hiếm vì bố thai nhi hoàn toàn bình thường. Tuy nhiên, theo thuyết Lyon, hiện tượng DMD xuất hiện ở trẻ em nữ có thể do NST X bình thường của bé gái bị bất hoạt và lúc này, NST mang gen bệnh lại hoạt động. Mặt khác, ở một số trẻ gái mắc hội chứng Turner, chỉ tồn tại một NST X duy nhất và nếu NST X này mang gen dystrophin đột biến thì trẻ gái sẽ biểu hiện bệnh [96].
Để khẳng định chắc chắn thai nhi không bị bệnh, chúng tôi tiến hành phân tích gen dystrophin của thai nhi. Vì anh trai của thai nhi có đột biến mất đoạn gen từ exon 46-50 nên chúng tôi tiến hành khuếch đại các exon này của thai nhi để kiểm chứng. Kết quả được biểu hiện ở hình 3.20, với cặp mồi khuếch đại exon 46, vạch DNA thu được ở bệnh nhân có kích thước bằng với đoạn DNA khuếch đại từ mẫu đối chứng dương. Chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến exon 46. Phân tích tương tự các exon khác chúng tôi đưa ra kết luận thai nhi không bị bệnh DMD.
Vấn đề cân nhắc được đưa ra là có nên phân tích gen để xác định xem thai nhi nữ này mang gen bệnh hay không. Theo cơ chế di truyền, một người phụ nữ mang gen có khả năng truyền gen bệnh cho 50% người con của họ, như vậy khi đến tuổi lập gia đình, tần suất truyền gen bệnh trong cộng đồng của thai nhi nữ này rất cao. Một số nhà nghiên cứu cho rằng, khi xác định thai nhi nữ mang gen bệnh, cần tư vấn di truyền cho gia đình, nếu thai phụ đã đông con và có ý muốn hủy bỏ thai thỡ nờn tiến hành phá bỏ thai nhi dị hợp tử để hạn chế khả năng lan truyền gen đột biến cho thế hệ sau.
Trong trường hợp nghiên cứu của chúng tôi, đây là lần mang thai thứ hai của thai phụ, lần đầu tiên người mẹ đã sinh con trai bị bệnh DMD. Do vậy chúng tôi thống nhất đưa đến kết luận không tiến hành xác định khả năng dị hợp tử của thai nhi, vì cho dù thai có mang gen bệnh thì chúng tôi vẫn khuyên thai phụ giữ thai, huỷ bỏ thai chắc chắn sẽ để lại tâm lý không tốt cho thai phụ lẫn các thành viên khác trong gia đình. Hơn nữa, hiện nay và trong tương lai, các kỹ thuật SHPT ngày càng hoàn thiện và phát triển nên vấn đề phát hiện người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh không còn là vấn đề khó khăn. Như vậy, nếu thai nhi nữ thật sự mang gen đột biến thì đến tuổi lập gia đình sẽ
được tư vấn tiến hành chẩn đoán trước sinh và chắc chắn sẽ hạn chế được việc sinh con bị bệnh DMD. Đối với trường hợp này, chúng tôi tư vấn thai phụ sau này phải đưa em bé đến khám và phân tích gen, trước khi em bé lập gia đình.
Các bệnh lý di truyền chiếm khoảng 20% các trường hợp tử vong trong giai đoạn sơ sinh cũng như chiếm một tỉ lệ rất cao những bệnh lý gặp phải trong thời kỳ nhũ nhi và trẻ nhỏ [40]. Tần suất cũng như mức độ nặng của các bệnh lý di truyền đơn gen thay đổi tùy theo từng chủng tộc và có thể chiếm đến 2% tất cả trẻ sơ sinh [105]. Theo thống kê của Nguyễn Văn Đông, tỷ lệ thai dị tật bẩm sinh ở Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương trong ba năm 2001- 2003 là 2,7% [3]. Việc điều trị các bệnh lý di truyền vẫn còn là một thách thức lớn đối với nền y học. Phần lớn bệnh nhân vẫn tử vong, để lại hậu quả nặng nề cho gia đình và xã hội. Hiện nay, nhờ sự tiến bộ của y học và đặc biệt là ngành SHPT, một số bệnh lý di truyền có thể được điều trị khả quan hơn. Tuy nhiên, trước khi có những phương pháp điều trị triệt để các bệnh lý di truyền bằng liệu pháp gen thì việc chẩn đoán trước sinh và phòng bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động những thai nhi mắc phải những bệnh lý nặng nề là một lựa chọn được nhiều người đồng thuận. Chớnh vỡ những lý do trên mà tầm quan trọng của công tác chẩn đoán trước sinh ngày càng được nhấn mạnh. Với sự phát triển nhanh chóng của các chuyên ngành sản khoa, nhi khoa, chẩn đoán hình ảnh và đặc biệt là di truyền phân tử thì chẩn đoán trước sinh sẽ phát triển mạnh mẽ hơn nữa, đạt được sự đồng thuận khoa học và đạo đức học để hạn chế sự lưu hành của các bệnh lý di truyền, đặc biệt là các bệnh lý di truyền nặng nề.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra kết luận sau: