- 8 0 ả g 3.3 : Kết ả t ử ng m SA t ên k áng ết t n t đượ vớ nồng độ
NỘI DUNG 4: Tạo các dòng ruồi chuyển genemang phức hợp gene IT.Duch và kiểm tra các dòng ruồi chuyển gene
IT.Duch và kiểm tra các dòng ruồi chuyển gene
4.1.Thiết lập các dòng ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH và định vị phức hợp gene này trên nhiễm sắc thể ruồi giấm chuyển gene
Sau khi chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm, các dòng ruồi chuyển gen được tuyển chọn dựa vào gen ch thị w cho phép ruồi mang gen mục tiêu có màu mắt đỏ. Chúng tôi chọn được bốn dòng ruồi dự đoán có mang gen mục tiêu (thông qua màu mắt). Các dòng ruồi có mã số như sau: #2 -8, #26-9.
Các dòng ruồi dự tuyển nêu trên được tiến hành làm thuần và ác định nhiễm sắc thể mang gen mục tiêu (UAS Ờ R.dUCH như đã trình bày trong phần vật liệu, phương pháp. Toàn bộ công việc nêu trên được tiến hành tại Phòng thắ nghiệm Công nghệ nhiễm sắc thể, Viện Công nghệ kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản.
Kết quả định vị gene mục tiêu trong ruồi chuyển gene được tổng hợp trong bảng như sau:
Bảng 4.1. Danh sách các dòng ruồi mang phức hợp gene UAS-IR.dUCH
UAS-IR. dUCH line Chromosome
linkage Genotype
#24-8 III w;+; UAS-IR.dUCH
#26-9 III w;+;UAS-IR.dUCH/TM3
(homo lethal)
Sau khi làm thuần và ác định nhiễm sắc thể mang gen mục tiêu, các dòng ruồi chuyển gen được chuyển về Việt Nam. Chúng tôi tiếp tục tiến hành kiểm tra phân tắch các dòng ruồi này.
Trước tiên, chúng tôi tiến hành kiểm tra hiệu quả knoc-down gene dUCH trong các dòng ruồi chuyển gene bằng phương pháp ác định hàm lượng mRNA của gene dUCH trong các mô đ ch bằng kỹ thuật RT-PCR định lượng và ác định protein dUCH trong ruồi chuyển gene.
- 85 -
4.2.Kiểm tra hiệu quả knock-down gene dUCH trong ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH
Trong các thắ nghiệm kiểm tra hiện quả knock-down gene dUCH, chúng tôi sử dụng tổ hợp GMR-Gal4 kết hợp với phức hợp UAS-IR.dUCH nhằm biểu hiện protein Gal4, kéo theo sự biểu hiện dsRNA trong mô mắt ruồi. Thu nhận mô tiền phân sinh mắt, tiến hành định lượng mRNA của dUCH bằng kỹ thuật real time PCR và thực hiện lai western blot với kháng thể kháng dUCH. Trong các thắ nghiệm này, chúng tôi so sánh lượng mRNA dUCH trong các dòng ruồi chuyển gene với lượng mRNA dUCH trong dòng ruồi hoang dại Canton S. Sử dụng rp49 như gene tham chiếu và act5C như đối chứng âm. Kết quả RT-PCR cho thấy lượng mRNA dUCH giảm 36% trong dòng ruồi 24-8; và giảm 73% trong dòng ruồi 26-9 trong khi đó không có sự khác biệt về lượng mRNA act5C giữa dòng ruồi hoang dại (hình 3.1) và các dòng ruồi chuyển gene. Kết quả western blot cũng cho thấy ở các dòng ruồi chuyễn gene, sự biểu hiện protein dUCH giảm đi so với dòng ruồi hoang dại Canton S, ở dòng 26-4 sự biểu hiện protein dUCH giảm mạnh hơn so với dòng 24-8.
Các kết quả thắ nghiệm cho thấy, các dòng ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH chúng tôi đã thiết lập có khả năng knock-down gene dUCH. Chúng tôi tiếp tục sử dụng các dòng ruồi chuyển gene này để khảo sát ảnh hưởng của sự knock- down dUCH trong mô mắt và mô não ruồi nhằm bước đầu phân tắch vai trò chức năng của dUCH trong sự phát triển các mô, cơ quan cũng như vai trò của dUCH trong bệnh Parkinson.
- 86 -
Hình 4.1.Hiệu quả knock-down dUCH trong các dòng ru i chuyển gene.
A. Đ n lượng mRNA dUCH trong các dòng ruồi chuyển gene. B.Kiểm tra sự biểu
- 87 -