- 2 5gen ch thị thường là kháng kháng sinh.
d. Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và Xho
Tiến hành cắt kiểm tra plasmid cho kết quả dương t nh với cặp mồi đặc hiệu của gen bằng hai enzyme cắt giới hạn EcoRI và XhoI.. Sản phẩm cắt sẽ gồm 2 đoạn: đoạn có k ch thước khoảng 2900bp tương ứng với plasmid pBluescript KS (+ được xử lý với EcoRI và Xho , đoạn ngắn có k ch thước 0bp tương ứng với gen NdUch-L1.
- 34 -
Phản ứng được tiến hành với các thành phần sau:
MilliQ 4,0l
Buffer Tango 10X 4,0l
Plasmid pB/NdUch-L1 10,0l
Enzyme EcoRI (10u/l) 1,0l Enzyme XhoI (10u/l) 1,0l
Tổng thể tắch 20l
Sản phẩm cắt được chạy điện di trên gel agarose % để kiểm tra.
2.10.Kiểm tra các dòng vector tái tổ hợp bằng phương pháp giải trình tự
Các vector tái tổ hợp được tiến hành kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự và so sánh độ chắnh xác của trình tự với dữ liệu trên ngân hàng gen. Với phần thắ nghiệm này, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp, tinh sạch và gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogene, Hàn Quốc. Các trình tự và kết quả giải trình tự được phân tắch bằng phần mềm Jellyfish.
2.11.Tổng hợp double-stranded (dsRNA)
PCR plasmid pBluescript/Cudh-l1 với cặp mồi T3, T7 nhằm tạo đoạn DNA có mang promoter T3 và T7. Sản phẩm PCR sẽ đýợc tinh sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng tạo dsRNA sử dụng bộ KIT RiboMax T7 (Promega) và MEGAscript T3 (Ambion) theo hýớng dẫn của nhà sản xuất.
2.12.Kiểm tra sự khả năng knock down dUCH trong tế bào S2
Để kiểm tra hiệu quả knock-down sự biểu hiện gene dUCH bằng các cấu trúc dsRN đã thiết kế, trước hết, chúng tôi thử nghiệm trên tế bào nuôi cấy. Tế bào S2 (Cat N0 R69007, Invitrogen) là dòng tế bào phân lập từ phôi ruồi thời điểm 20 Ờ 24g. Nuôi cấy tế bào S2 với mật độ ban đầu là 105 tế bào/ giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng với môi trường M3. Sau 24g xử lý tế bào với dsRNA dUCH ở các nồng độ khác nhau (30; 32,5; 35; 37.5; 40g/giếng trong h, sau đó bổ sung môi trường M3 và nuôi cấy
- 35 -
tiếp trong các khoảng thời gian khác nhau 0, 2, 4, 6, 8 ngày. Thu tế bào sau các khoảng thời gian nuôi cấy nêu trên, phá v tế bào, thu nhận RNA và thực hiện phản ứng Real time PCR với mồi đặc hiệu cho gene dUCH hoặc thu nhận protein tổng và thực hiện western blot với kháng thể kháng dUCH. Thực hiện tương tự với các lô thắ nghiệm đối chứng xử lý bằng dsRNA LacZ hoặc không xử lý bằng dsRNA, ch xử lý bằng dH2O. Các thắ nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện trên 3 giếng giống nhau. Xử lý dữ liệu thực nghiệm bằng chương trình e cel.
Trong các thắ nghiệm này, khi phân tắch bằng Western blot chúng tôi sử dụng kháng thể kháng dUCH ở nồng độ 1:10,000 và kháng thể kháng tubulin IgG (Sigma) ở nồng độ 1:2,000
2.13.Định lýợng mRNA dUCH bằng phýõng pháp real-time RT-PCR
Để định lượng mRNA trong các tế bào S2 sau khi xử lý với dsRN dUCH cũng như định lượng mRNA tại các mô biểu hiện cấu trúc dsRNA dUCH, chúng tôi thu nhận RNA tổng số từ các tế bào, hoặc mô bằng TrizolReagent (Invitrogen), sử dụng 1g RNA tổng số trong các phản ứng phiên mã ngược với mồi oligo dT bằng Takara high fidelity RNA PCR kit (Takara). Phản ứng real-time PCR được thực hiện tiếp theo đó với 4l sản phẩm phiên mã ngược bằng SYBR Green I kit (Takara) trên hệ thống Applied Biosystems 7500 Real Time PCR. Số lượng mRNA dUCH trong các lô thắ nghiệm được so sánh thông qua phương thức so sánh trị giá CT. Trong đó rp49 (145bp) được sử dụng như là gene tham chiếu (endogenous reference gene), act5C (140bp) được sử dụng như đối chứng âm. Các thắ nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần cho mỗi lô.