- 39trường hợp xảy ra như sau:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
2.1.3. Kiểm tra dòng tế bào tái tổ hợp pBlue/NdUch-L1 bằng phương pháp giải trình tự
trình tự
Plasmid pBlue/NdUch thu nhận từ các thì nghiệm trên được tinh sạch và tiến hành giải trình tự. Kết quả giải trình tự được trình bày trên hình sau:
- 59 -
Hình 2.5. Kết quả giải trình tự c a plasmid tái tổ hợp pBlue/NdUch
Tiến hành sắp gióng cột kết quả giải trình tự gene Nduch của plasmid tái tổ hợp pBlue/NdUch với gen dUch ( trình tự gen dUch được lấy từ NCBI ), kết quả cho thấy độ tương đồng là 00%. Như vậy, chúng tôi kh ng định đã thành côngtrong việc dòng hóa gen NdUch vào plasmid pBluescript II KS (+).
- 60 -
2.2.Tạo dòng gen Nduch và Cduch vào plasmid pUAST
Plasmid pUAST mang các yếu tố cho phép chèn gen vào nhiễm sắc thể của nấm men như: nhân tố trợ giúp chuyển gen P, gen ch thị w cho phép khôi phục tắnh trạng mắt đỏ ở ruồi giấm đột biến gen mắt trắngẦBởi những thuộc t nh đặc biệt này, plasmid pU ST được chọn sử dụng cho việc dòng hóa gen NdUch và CdUch, nhằm chuyển vào cơ thể ruồi giấm, phục vụ cho nghiên cứu knock down gen Uch trong các thắ nghiệm sau. Cũng như phần 2, trong báo cáo này chúng tôi xin phép trình bày các kết quả thực nghiệm trên gene NdUCH.
2.2.1.Thu nhận gen NdUch và thu nhận plasmid pUAST/EcoRI, XhoI
Thông qua phương pháp PCR, gen NdUch được khuếch đại từ đoạn cDNA của gen với cặp mồi đặc hiệu 3Ỗ-EcoRI-NdUch và Ỗ-XhoI-NdUch. Sản phẩm PCR sẽ có k ch thước 0bp theo như đã được thiết kế.
Song song với việc thu nhận gen NdUch, chúng tôi tiến hành thu nhận plasmid pUAST bằng phương pháp SDS kiềm. Sau đó, plasmid này được cắt mở vòng bằng 2 enzyme cắt giới hạn EcoRI và Xho . Sau khi được xử lý bằng 2 enzyme trên plasmid pUAST sẽ có k ch thước khoảng 8500bp.
Tiến hành điện di sản phẩm PCR thu gen NdUch và sản phẩm plasmid pUAST/EcoRI, XhoI trên gel agarose 1% cùng với thang DNA chuẩn Kb để kiểm tra k ch thước. Kết quả được trình bày trên hình:
- 61 -
Hình 2.6. A: Thu nhận gen NdUch. 1: thang DNA chuẩn 1Kb; 2: sản phẩm PCR
gen NdUch; B: Thu nhận plasmid pUAST/EcoRI, XhoI . 1: plasmid pUAST; 2: plasmid pUAST/ EcoRI, XhoI; 3: thang DNA chuẩn 1Kb
Ở giếng 2 (hình A) cho thấy có một vạch nằm giữa vạch 250bp và 500bp của thang DNA chuẩn kb, có k ch thước khoảng 450bp, bằng với k ch thước của gen
NdUch đã được thiết kế. Như vậy chúng tôi đã thu nhận được gen NdUch. Sau đó, sản
phẩm PCR thu nhận gen được tinh sạch, tiếp theo được xử lý với EcoRI, XhoI và tiến hành tinh chế một lần nữa trước khi thực hiện phản ứng nối đầu dắnh vào plasmid pUAST/EcoRI, XhoI.
Ở giếng 2 (hình B), kết quả điện di cho thấy xuất hiện 1 vạch, nằm giữa vạch 8000bp và 10000bp của thang DNA chuẩn Kb, k ch thước khoảng 8 00bp, hơn nữa so sánh với plasmid pUAST ở giếng 1 gồm 2 vạch tương ứng với hai trạng thái tự nhiên khác nhau của plasmid, chúng tôi kết luận phản ứng cắt plasmid pUAST bằng enzyme EcoRI và Xho đã thành công. Sản phẩm cắt được thu nhận, tinh chế và chuẩn bị dùng trong phản ứng nối đầu dắnh với gen NdUch.
- 62 -
Nồng độ và độ tinh sạch của gen NdUch và plasmid pUAST sau khi xử lý với
EcoRI và Xho được ác định bằng máy đo Nanodropệ. Kết quả được ghi nhận trên Bảng 1.2.
Bảng 1.2: Kết quả đo nồng độ plasmid pUAST/EcoRI, XhoI và gen NdUch
/EcoRI, XhoI sau khi tinh sạch
Nồng độ (g/ộl) OD260/OD280
pUAST/EcoRI, XhoI 1400 1.82
Gen NdUch 486 1.95
Sản phẩm khuếch đại gen NdUch đã cắt và tinh chế được nối vào plasmid pUAST/EcoRI, Xho để tạo vector tái tổ hợp. Sau đó, bằng phương pháp hóa biến nạp, sản phẩm nối được đưa vào tế bào khả nạp E. coli DH5. Trên plasmid pUAST mang gen chọn lọc kháng kháng sinh, do vậy, chúng tôi sử dụng môi trường LB- mp 00 để sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp.
2.2.2.Kiểm tra dòng tế bào tái tổ hợp mang gen NdUch
Các dòng khuẩn lạc trắng được kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gen NdUch. Thắ nghiệm được tiến hành với mẫu chứng âm là thành phần PCR không chứa plasmid. Sản phẩm kiểm tra được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trên hình 1.14.
Kết quả điện di cho thấy tại các giếng 6, 8, 9, 11, 13 cho vạch tương ứng với vạch gen NdUch. Các giếng còn lại không xuất hiện vạch là do các khuẩn lạc mang vector pUAST tự nối, vì không mang gen nên không cho tắn hiệu với cặp mồi đặc hiệu của gen. Giếng 2 là giếng chứng âm nhằm đảm bảo cho các kết quả thực nghiệm và các mẫu thắ nghiệm cho kết quả dương t nh là do sự khác biệt về khuôn mẫu plasmid. Những điều trên chứng tỏ thể biến nạp thuộc các khuẩn lạc nói trên có mang gen
- 63 -
Hình 2.7. Kết quả PCR khuẩn lạc bằng mồ đặc hi u c a gen NdUch-L1. 1: thang
DNA chuẩn 1Kb; 2: gen NdUch; 3: sản phẩm PCR không chứa DNA; 4-13: sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng mồ đặc hi u c a gen
Các thể biến nạp E.coli đã được xác nhận có mang gen NdUch được tiếp tục nuôi cấy, tách chiết và thu nhận plasmid. Các plasmid này một lần nữa được kiểm tra bằng phương pháp cắt giới hạn EcoRI và XhoI. Kết quả kiểm tra được điện di trên gel agarose 1% và trình bày trên hình 2.8.
Hình 2.8. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp pUAST/NdUch. 1: thang DNA chuẩn 1
Kb; 2: pUAST/EcoRI, XhoI; 3: gen NdUch; 4: vector tái tổ hợp được xử lý bằng EcoRI và XhoI; 5: PCR từ vector tái tổ hợp bằng cặp mồ đặc hi u c a gen; 6: sản phẩm PCR
- 64 -
Khi cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và XhoI (giếng 4),kết quả điện di gồm 2 vạch: vạch trên có k ch thước bằng với vạch pU ST đã cắt ( giếng 2), vạch dưới có k ch thước bằng với vạch gen (giếng 3). Hơn nữa, kết quả PCR bằng mồi đặc hiệu của gen từ vector tái tổ hợp cho vạch tương ứng với vạch gen.
Như vậy chúng tôi đã thành công trong việc dòng hoá gen NdUch vào plasmid pUAST và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Vector tái tổ hợp được kắ hiệu là pUAST/NdUch.