- 2 5gen ch thị thường là kháng kháng sinh.
NỘI DUNG 3: Tạo kháng thể kháng dUCH
3.1.Cấu trúc vector biểu hiện protein dUCH-L1 trong E. coli Thu nhận gene uchl1
Dựa trên trình tự gene uchl1 của D. melanogaster trên ngân hàng gene, mồi được thiết kế, tổng hợp và dùng trong PCR để khuếch đại gene uchl1 từ cDNA của gene này.
- 36 -
Ngoài ra, các mồi mang trình tự nhận biết bởi các enzyme cắt hạn chế là NdeI và EcoRI. Pfu được sử dụng để khuếch đại chắnh xác trình tự gene. Chương trình PCR như sau: chu kỳ: 95oC/4 phút, 25 chu kỳ: 94oC/45s; 55oC/45s; 72oC/45s; 1 chu kỳ: 72oC/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose với thang DNA chuẩn.
Kiểm tra trình tự uchl1
Gene uchl1 thu được từ PCR được cắt với NdeI và EcoRI. Đoạn DN thu được từ phản ứng cắt được nối vào vector biểu hiện pET-28a (vector cũng đã được cắt với các en yme này để tạo vector ký hiệu là pET-uchl1 và giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Trình tự gene sau đó được so sánh với trình tự trên ngân hàng gene bằng phần mềm Jellyfish.
3.2.Cảm ứng sự biểu hiện gene và phân tắch bằng SDS-PAGE và Western blot
Plasmid pET-uchl được biến nạp vào E. coli BL21 (DE3). Tế bào chứa plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường LB chứa kanamycin đến khi đạt giá trị OD600=0,6- và được cảm ứng biểu hiện protein dung hợp 6xHis-UCHL1 bằng cách bổ sung IPTG (isopropyl β-D thiogalactoside) ở nồng độ 0,4mM. Mức độ protein tạo ra được kiểm tra bằng SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu đối chứng âm là dịch phá màng
của E. coli BL21 (DE3) chứa pET-uchl không được cảm ứng và E. coli BL21 (DE3) chứa
plasmid pET-28a có cảm ứng và không bằng IPTG.
Western blot
Protein sau điện di được chuyển lên màng nitrocellulose (blotting). Protein dung hợp được phát hiện nhờ kháng thể chuột kháng His (bắt đặc hiệu với đuôi 6 His và kháng thể kháng kháng thể chuột đánh dấu HRP. Kit C ( mersham Biosciences được sử dụng trong bước hiện phim theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.3.Tinh chế protein tái tổ hợp và gây đáp ứng miễn dịch
Cột Ni-NT được sử dụng để tinh chế 6xHis-UCH theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- 37 -
100ộg 6xHis-UCH trong ml nước muối sinh lý được trộn đều với 1ml complete reundỖs adjuvant (C . Tiêm 2ml hỗn hợp trên lưng thỏ. Trước khi tiêm thỏ lần đầu, thu nhận huyết thanh để kiểm tra em đã có sẵn kháng thể kháng 6xHis-UCH chưa. Tiêm nhắc sau mỗi tháng với lượng protein giảm đi một nửa và thay CFA bằng IFA (Incomplete reundỖs adjuvant .
3.4.Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng huyết thanh với 6xHis-UCHL1.
Máu thu từ tĩnh mạch tai thỏ được để đông tự nhiên. Sau bước ly tâm, kháng huyết thanh được thu nhận và sử dụng trong phản ứng S và lai estern blot để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng UCHL1.
Tiến hành Western Blot với protein tổng số thu nhận từ buồng trứng của ruồi cái để kiểm tra sự đặc hiệu của kháng thể.