- 39trường hợp xảy ra như sau:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
2.1.1 Thu nhận gen NdUch và thu nhận plasmid pBluescript/EcoRI, Xho
Gen NdUch được thu nhận bằng phản ứng PCR từ cDNA của gen với cặp mồi
đặc hiệu 3Ỗ-EcoRI-NdUch và Ỗ-XhoI-NdUch. Theo như đã được thiết kế, sản phẩm PCR sẽ có k ch thước 450bp.
Song song đó, plasmid pBluescript KS (+ được tách chiết bằng phương pháp SDS kiềm. Tiếp theo đó, plasmid này được cắt mở vòng bằng 2 enzyme cắt giới hạn
EcoRI và XhoI. Sản phẩm vector pBluescript II KS (+) sau khi cắt bằng 2 enzyme trên có sẽ có k ch thước khoảng 2900bp.
Tiến hành điện di sản phẩm PCR thu gen NdUch và sản phẩm plasmid pBlue/EcoRI, XhoI trên gel agarose 1% cùng với thang DNA chuẩn Kb để kiểm tra k ch thước. Kết quả được trình bày trên hình sau:
- 54 -
Hình 2.1. A: Thu nhận gen NdUch: 1: thang DNA chuẩn 1Kb; 2: sản phẩm PCR thu
nhận gen NdUch. B: Thu nhận plasmid pBluescript/EcoRI, XhoI : 1: plasmid pBluescript II KS (+); 2: pl sm d pBl e s k được xử lý với EcoRI, XhoI
; 3: thang DNA chuẩn 1Kb
Kết quả điện di ở hình A cho thấy giếng 2 ch có một vạch nằm giữa hai vạch 250bp và 500bp của thang DNA chuẩn kb, có k ch thước tương đương 0bp, đúng với k ch thước của gen NdUch đã được thiết kế. Như vậy chúng tôi đã thu nhận được
gen NdUch. Sản phẩm khuếch sau đó được tinh sạch, tiếp theo được xử lý với EcoRI,
XhoI và tiếp đó tinh chế một lần nữa trước khi thực hiện phản ứng nối đầu dắnh vào plasmid pBlue/EcoRI, XhoI.
Kết quả điện di ở hình B cho thấy giếng 2 xuất hiện 1 vạch, nằm gần vạch 3000bp của thang DNA chuẩn Kb, có k ch thước khoảng 2900bp, hơn nữa so sánh với plasmid pBlue không qua xử lý với 2 enzyme EcoRI và XhoI ở giếng 1 có 2 vạch tương ứng với hai trạng thái tự nhiên khác nhau của plasmid, chúng tôi kết luận phản ứng cắt plasmid pBluescript II KS (+) bằng enzyme EcoRI và Xho đã thành công. Sản phẩm cắt được thu nhận, tinh chế và chuẩn bị dùng trong phản ứng nối đầu dắnh với
- 55 -
Nồng độ và độ tinh sạch của gen NdUch và plasmid pBlue sau khi xử lý với
EcoRI và Xho được ác định bằng máy đo Nanodropệ. Kết quả được ghi nhận trên Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Kết quả đo nồng độ plasmid pBlue/EcoRI, XhoI và gen NdUch sau khi tinh sạch
Nồng độ (g/ộl) OD260/OD280
pBlue/EcoRI, XhoI 1220 1.9
Gen NdUch 486 1.95
ene và vector đã chuẩn bị được sử dụng trong phản ứng nối. Chúng tôi biến nạp kết quả nối vào tế bào E. coli DH5 và sàng lọc bằng phương pháp sàng lọc bổ trợ alpha
2.1.2.Kiểm tra dòng tế bào tái tổ hợp mang gen NdUch PCR khuẩn lạc bằng mồi T3/T7
Các dòng khuẩn lạc trắng được kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3/T7. Thắ nghiệm được tiến hành với chứng dương là plasmid pBlue. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện trên (hình 2.2).
- 56 -
Hình 2.2. Kết quả PCR khuẩn lạc trắng bằng mồi T3/T7. 1: thang DNA chuẩn 1Kb; 2:
sản phẩm PCR bằng T3/T7 với khuôn là plasmid pBlue; 3-12: các khuẩn lạ được chọn PCR bằng mồi T3/T7
Kết quả điện di cho thấy ở giếng , ,8, đều xuất hiện 1 vạch có k ch thước bằng với vạch ở giếng 2 dùng làm chứng dương, sản phẩm PCR bởi mồi T3/T7 với khuôn là plasmid pBlue. Điều đó cho kết luận rằng các thể biến nạp được chọn tương ứng với các giếng 4,5,8,11 chứa vector pBlue tự nối. Ở các giếng còn lại, gồm giếng 3,6,7,9,10,12, kết quả điện di cho thấy tồn tại 1 vạch nằm giữa vạch 500bp và vạch 750bp của thang DNA chuẩn Kb, có k ch thước tương đương 600bp, bằng với kắch thước của sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pBlue/NdUch với mồi T3/T7 được dự đoán. ới kết quả này, chúng tôi đã bước đầu chọn được các khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pBlue/NdUch. Tiếp theo đó, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các khuẩn lạc này và tách plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm nhằm thu plasmid phục vụ cho việc kiểm tra bằng mồi đặc hiệu ở bước tiếp theo.
PCR plasmid bằng mồi đặc hiệu của gen
Tiến hành PCR plasmid thu nhận được ở trên bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen 3ỖEcoRI-NdUch và ỖXhoI-NdUch. Thắ nghiệm được thực hiện với chứng dương là
- 57 -
gen NdUch-L1 và chứng âm là mẫu PCR không chứa plasmid. Sản phẩm khuếch đại
được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện trên hình 2.3như sau:
Hình 2.3. Kết quả PCR plasmid bằng mồ đặc hi u c a gen Nduch. 1: thang DNA
chuẩn 1Kb; 2: gen NdUch; 3: mẫu PCR không chứa plasmid; 4-9: P R pl sm d được chọn bằng mồ đặc hi u c a gen NdUch
Có thể nhận thấy, trong số 6 plasmid được kiểm tra, những plasmid ở các giếng , ,7,9 khi được tiến hành PCR bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen NdUch thì cho sản phẩm khuếch đại có k ch thước bằng với k ch thước gen NdUch ở giếng 2 là 450bp. Như vậy, các plasmid trên là các plasmid tái tổ hợp có mang gen NdUch. Những plasmid ở giếng 6 và 8 không cho tắn hiệu với phản ứng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của gen chứng tỏ chúng không mang gen NdUch. Nhưng phản ứng PCR khuẩn lạc bằng mồi T3/T7 của 2 plasmid này đã thực hiện ở trên vẫn cho kết quả giống như các plasmid tái tổ hợp có mang gen NdUch. Kết quả này có thể đến từ nhiều nguyên nhân khác nhau, một trong các nguyên nhân là do sự khuếch đại ky sinh xảy ra trong quá trình PCR hoặc do các khuẩn lạc mọc quá gần nhau nên có sự tạp nhiễm trong thao tác, tạo trường hợp dương t nh giả.
Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang gen NdUch
Nhằm một lần nữa kiểm chứng kết quả thắ nghiệm trên, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt giới hạn đối với các plasmid tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng PCR và cho
- 58 -
kết quả dương t nh (có mang gen NdUch) bằng 2 enzyme EcoRI và XhoI. Kết quả kiểm tra điện di trên gel agarose % được trình bày trên hình 1.9
Hình 2.4 Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp pBlue/NdUch; 1: thang DNA chuẩn 1 Kb;
2: pBue/EcoRI, XhoI; 3: vector tái tổ hợp được xử lý bằng EcoRI, XhoI; 4: sản phẩm PCR từ vector tái tổ hợp bằng cặp mồ đặc hi u c a gen
Khi cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và XhoI, ở giếng 4, xuất hiện 2 vạch, gồm vạch trên có k ch thước bằng với k ch thước vạch pBlue/EcoRI, XhoI (giếng 2), vạch dưới có k ch thước bằng với vạch gen (giếng 3).Hơn nữa, kết quả PCR bằng mồi đặc hiệu của gen từ vector tái tổ hợp cho vạch kết quả tương ứng với vạch gen.
Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc dòng hoá gen NdUch vào plasmid pBluescript II KS(+) và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Vector tái tổ hợp được kắ hiệu là pBlue/NdUch.