- 39trường hợp xảy ra như sau:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
2.3. Knockdown dUC Hở tế bào S
Plasmid tái tổ hợp pBluescript/Nduch sau khi PCR bằng cặp mồi T3,T7 đýợc dùng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp dsRNA, sản phẩm single-stranded RNA (ssRNA) tạo từ T7 RNA polymerase và T3 RNA polymerase cùng với mẫu dsRNA đýợc điện di kiển tra trên gel agarose 1% ( Hình 2.10).
Hình 2.10. Kết quả thu nhận dsRNA. 1. Thang 1kb. 2. T3-ssNduch-l1. 3. T7-
ssNduch-l1. 4. dsNduch-l1
dsRNA sau khi tinh sạch sẽ đýợc đo nồng độ và tiến hành chuyển 37,5 ug dsRNA vào 1x 105 tế bào S2, mẫu đýợc thu sau 0, 2, 4, 6, 8 ngày nuôi cấy và kiểm tra khả nãng knockdown dUCH của dsNduch-l1 bằng hai býớc, đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết mRNA và sử dụng làm khuôn cho phản ứng Realtime PCR nhằm định lýợng
duch mRNA có trong các mẫu, mRNA của actin5c đýợc sử dụng nhý đối chứng âm và
- 66 -
sử dụng dsLacZ nhý là một đối chứng âm. Kết quả thể hiện số lần khác biệt giữa việc xử lý dsNduch so với dslacZ vào tế bào S2 (Hình 2.11).
Hình 2.11. Kết quả đ n lượng mRNA. Đồ th thể hi n số lần khác bi t khi sử dụng
dsNduch so với dslacZ ở các mẫu thu ở 2,4,6,8 ngày.
Dựa vào đồ thị ta nhận thấy lýợng duch mRNA giảm dần theo thời gian và gần nhý về mất hoàn toàn ờ ngày thứ 8 trong khi actin5c mRNA thì gần nhý không thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy. Nhý vậy, býớc đầu chúng tôi có thể khẳng định đýợc
dsNuch có khả nãng knockdown dUCH.
Nhằm củng cố kết quả thắ nghiệm, chúng tôi tiến hành tách chiết protein tổng, chạy điện di SDS-PAGE và Western Blot với kháng thể kháng dUCH. Kết quả đýợc trình bày trên Hình 2.12. Nhý đã đýợc dự đoán, lýợng protein dUCH cũng giảm theo thời gian và vạch protein không thể phát hiện đýợc ở ngày thứ 8. Dựa trên kết quả thắ nghiệm, chúng tôi chọn ngày thứ 6 làm chuẩn để so sánh hàm lýợng dUCH khi chuyển
dsNduch và một dsRNA bất kỳ là dslacZ. Kết quả cho thấy lýợng dUCH giảm hẳn khi sử
- 67 -
Hình 2.12. dsNduch có khả nãng knockdown dUCH. A. Khảo sát ở các thời điểm 0, 2,
4, 6, 8 ngày sau khi knockdown bằng 37.5ug dsNduch trên mỗi giếng. Chứng âm là
mẫu không xử lý với dsNduch. B. Sử dụng dslacZ nhý là mẫu chứng âm. Nồng độ 37,5
ug/ giếng, trong 6 ngày.
Các kết quả thực nghiệm cho thấy, chúng tôi đã thiết kế thành công đoạn dsRNA có hiệu quả knock-down gene dUCH. Chúng tôi sẽ sử dụng thiết kế này để thiết lập dòng ruồi chuyển gene knock-down dUCH trong các thắ nghiệm sau.
- 68 -