NỘI DUNG 2: Sử dụng các kỹ thuật thao tác trên gene để dòng hóa gene mục tiêu vào các vector

- 2 5gen ch thị thường là kháng kháng sinh.

NỘI DUNG 2: Sử dụng các kỹ thuật thao tác trên gene để dòng hóa gene mục tiêu vào các vector

mục tiêu vào các vector

2.1 Thu nhận gen Nduch-L1 và gen CdUch-L1 bằng phản ứng PCR .

en được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của gen nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid pBluescript II KS(+) và plasmid pUAST. Thành phần phản ứng PCR dH2O 82 l pfu Buffer 5 l MgCl2 5 l dNTP 5 l Mồi F 0,5l Mồi R 0,5l NdUch-L1/CdUch-L1 1 l pfu polymerase 1 l Tổng thể tắch 100l

- 27 - Chương trình phản ứng: Chương trình phản ứng:

Hình 9. ương t ìn P R

Sản phẩm PCR sẽ được tinh chế bằng chroloform hoặc qua cột để đảm bảo độ tinh sạch cho các thao tác sau.

2.2.Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phenol-chroloform

- Sản phẩm PCR được thêm dH2O đủ 200l, trộn đều trong eppendorf 1,5 ml. - Thêm 200l chloroform vào và đảo nhẹ vài lần.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút.

- Hút dịch nổi phắa trên sang eppendorf khác và bổ sung thêm muối Natri acetat 3M pH 5,2 với thể tắch bằng 1/10 thể tắch dịch nổi thu được và 500l cồn tuyệt đối lạnh , sau đó trộn nhẹ và ủ ở tủ âm -20oC trong 15 phút.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút. - Đổ bỏ dịch nổi.

- Thêm 500l cồn 70o và ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. - Đổ bỏ dịch nổi và phơi tủa cho đến khô.

- Hoà tủa trong dung dịch TE 1X hay mili Q.

2.3.Tinh chế sản phẩm bằng bộ kit EZ-10 Spin Column DNA

- 28 -

- Chuyển hỗn hợp vào cột, để yên 2 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 1 phút, hút phần nước qua cột chuyển vào cột và thực hiện thêm một lần nữa. Sau đó loại bỏ phần nước qua cột này.

- Thêm 500l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ phần nước rửa qua cột, thực hiện thêm một lần rửa nữa rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong phút để đảm bảo đã loại hết dung dịch rửa.

- Thêm 30-50l dung dịch dung ly hay mili Q vào chắnh giữa cột, để yên khoảng 2 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút. Thực hiện ly tâm thêm lần nữa để đạt hiệu suất thu hồi tốt. Mẫu sau khi tinh chế sẽ được bảo quản ở -20oC.

2.4.Thu nhận plasmid pBluescript II KS (+), pUAST bằng phương pháp SDS- kiềm

- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH α mang plasmid pBluescript KS (+ vào ống nghiệm chứa ml môi trường B đã bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100g/ml, nuôi cấy lắc 250 rpm ở 37oC qua đêm.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút thu sinh khối vào 2 eppendorf 1,5ml, rửa sinh khối với ml nước cất, và ly tâm thu lại sinh khối.

- Thêm 100l dung dịch , vorte kĩ. Cho tiếp 200l dung dịch vào và đảo nhẹ vài lần, rồi thêm tiếp 150l dung dịch vào, đảo nhẹ.

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút, thu phần dịch nổi. Bổ sung 10 l Rnase và ủ 37oC trong khoảng 1 giờ.

- Thêm 250l phenol pH 8 + 250l chloroform vào và đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, thu lớp phắa trên.

- Cho tiếp 500l chloroform rồi đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, thu lớp phắa trên.

- 29 -

- Bổ sung muối Natri acetat pH 5,2 với thể tắch bằng 1/10 thể tắch dịch thu được và 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh , ủ ở tủ âm khoảng 30 phút rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, thu tủa.

- Thêm 500l ethanol 70o, ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút, đổ bỏ phần nước, giữ tủa. Để eppendorf trên giấy thấm để làm khô tủa.

- Khi tủa khô và sạch nước thì thêm 30l dung dịch TE 1X hay miliQ để hoà tủa và cất giữ ở -20oC.

2.5.Xử lý plasmid pBluescript II KS (+) bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI, XhoI;

plasmid pUAST bằng từng cặp enzyme EcoRI, XhoI và XhoI, BglII

Enzyme EcoRI, XhoI và BglII là các enzyme cắt giới hạn loại II và có vị trắ nhận biết duy nhất trong vùng MCS trên pBluescript KS (+ và pU ST. Do đó, khi cắt những plasmid bằng từng cặp en yme như trên, plasmid sẽ được mở vòng tạo hai đầu dắnh. Thành phần phản ứng cắt như sau: MilliQ 18l Buffer Tango 10X 10l Plasmid (2-2,5ộg/ộl) 20l Enzyme (10u/l) (x2) 1l Tổng thể tắch 50l

Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ ở 37oC, 4 giờ. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose % để kiểm tra.

2.6.Xử lý gen NdUch-L1 bằng từng cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI, XhoI và hUch-L1 bằng enzyme XhoI, BglII

Thành phần phản ứng cắt như sau:

Buffer Tango 10X 10 l

- 30 -

Enzyme (10u/l) (x2) 1l Tổng thể tắch 50l

Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ ở 37oC, 4 giờ. Sản phẩm cắt được tinh sạch và được điện di trên gel agarose % để kiểm tra.

2.7. Tạo vector tái tổ hợp pB/NdUch-L1,pB/CdUCH; pUAST/NdUch-L1, pUAST/CdUch-L1 pUAST/CdUch-L1

Các phản ứng nối đoạn DN vào vector được thực hiện nhờ hoạt động của enzyme T4 DNA ligase. Bản chất của phản ứng nối này là hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu ỖP của đoạn DN và đầu 3ỖOH của một đoạn DNA khác.

Sản phẩm cắt các plasmid và sản phẩm cắt của gen sau khi được tinh sạch được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng nối đầu dắnh với thành phần phản ứng như sau:

Buffer T4 DNA ligase 10X 1,5l

Gen (0,5ộg/ộl) 10l

Plasmid(1ộg/ộl) 2l

Enzyme T4 DNA ligase (4u/l) 1,5l

Tổng thể tắch 15l

Phản ứng nối được thực hiện ở 22oC trong 4 giờ, sau đó ủ ở 65oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme, và giữ ở 4oC.

2.8.Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả nạp bằng phương pháp hoá biến nạp

10 l hỗn hợp sản phẩm nối được trộn đều vào 100 l tế bào E. coli DH5α khả nạp trong eppendorf. Rồi thực hiện sốc nhiệt theo qui trình sau :

- Để lạnh 4oC trong 10 phút - Giữ 42oC trong 90 giây - Giữ lạnh 4oC trong 15 phút.

- 31 -

Sau đó trải hỗn hợp này trên đĩa B-Amp100-X-gal đối với vector pBlue, LB- mp đối với vector pU ST. Đĩa sau khi trải sẽ được ủ 37oC trong khoảng 16-18 giờ. Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E. coli DH5 không được bổ sung sản phẩm nối trong quá trình biến nạp.

2.9. Tuyển chọn thể biến nạp mang vector tái tổ hợp pB/NdUch-L1 hoặc pB/CdUCH-L1 pB/CdUCH-L1