- Các kết quả chứng minh mối liên quan giữa việc knockdown duch
2. Mối quan hệ giữa protein UCH-L1 và bệnh Parkinson 1 Protein UCH-L1 vai trò và chức năng
2.2. Mối liên quan giữa protein UCH-L1 và bệnh Parkinson
Đột biến trên gen UCH- , 93M, được phát hiện năm 998 ở một cặp song sinh người Đức, đây là đột biến thay thế isoleucine thành methionine tại amino acid thứ 93 của UCH-L1. Trên mô hình chuột chuyển gen biểu hiện đột biến I93M, nguời ta nhận thấy có sự suy giảm theo thời gian lượng tế bào sản sinh dopamine dẫn đến sự suy giảm lượng dopamine. Thêm vào đó, sự tắch tụ UCH-L1 và ubiquitin trong chuột chuyển gen cũng được nhận thấy [29]. Do đó, có nhiều nghiên cứu cho rằng t nh độc gây bởi đột biến I93M có thể là nhân tố chắnh gây nên bệnh Parkinson hơn là khả năng giảm chức năng của UCH-L1. Một số giả thiết cho rằng đột biến này dẫn đến làm giảm hoạt tắnh của enzyme hydrolase và enzyme nối ubiquitin với protein mục tiêu 3. Năm 2008, Kabuta và cộng sự cho rằng đột biến này làm tăng sự tương tác với receptor Lamp2a so với dạng bình thường, điều này được cho là dẫn đến nguy cơ mắc bệnh, tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi xung quanh vấn đề này. Lamp2a (lysosome-associated membrane protein type 2A) kết hợp cùng với các chaperon như HSc70 (heat shock cognate protein 70) và HSp90 (heat shock protein 90) hình thành thụ thể trên màng của hệ thống phân giải nhờ lysosome qua trung gian chaperone (chaperone-mediated autophagy-CMA) [Kabuta, 2008]. Tuy nhiên, UCH-L1 không phải cơ chất của CMA trong khi đó α-synuclein lại là cơ chất của CMA. Vì vậy có thể tương tác này dẫn tới tắch tụ α-synuclein trong tế bào, làm tăng nguy cơ mắc bệnh. Mặt khác, một số nghiên cứu cho rằng sự biểu hiện vượt mức UCH-L1 có thể dẫn tới tắch tụ α-synuclein do lúc này UCH-L1 không có chức năng thủy phân ubiquitin mà nó chuyển thành dạng dimer có
- 11 -
hoạt tắnh nối ubiquitin vào phân tử α-synuclein qua liên kết lysine K63, khi đó α- synuclein được đánh dấu bởi ubiquitin sẽ không bị hệ thống proteasome nhận ra để phân hủy dẫn đến tắch tụ với số lượng nhiều. Khi Anderson và cộng sự (2011) tiến hành kết hợp các kỹ thuật sinh hóa khác nhau nhằm nghiên cứu tác động của đột biến I93M về cơ cấu và sự ổn định của UCH-L1 cho thấy đột biến kém ổn định hơn dạng hoang dại, nhất là trong phương pháp đo động lực tháo gấp cuộn (Unfolding kinetic) của cấu hình protein ba chiều cho thấy đột biến có khả năng tháo gấp cuộn nhanh hơn 10 nếp gấp so với dạng hoang dại . Hơn nữa, các dạng trung gian khi tháo gấp cuộn của I93M có khả năng tương tác bất thường với tubulin và các thành phần của hệ thống phân hủy bằng lysosome qua trung gian chaperone, đặc biệt khi nó để lộ diện tắch bề mặt kỵ nước có thể tương tác với chaperon HSc70 và HSp90. Điều này có thể làm giảm hoạt tắnh thủy phân cũng như cấu trúc xoắn bậc 2 của I93M so với dạng hoang dại. Do đó, đột biến I93M có thể đã làm thay đổi cấu trúc UCH-L1, dẫn đến hoạt tắnh sinh hóa bị thay đổi.
Trái lại, đột biến S 8 , đột biến thay thế serine thành tyrosine tại amino acid thứ 18 của UCH- được công bố lần đầu tiên vào năm 999 được cho là làm giảm nguy cơ mắc bệnh Parkinson. Đột biến này thường thấy ở người Trung Quốc (~50%), người Nhật Bản (39- % , nhưng hiếm thấy ở người Châu Âu (14-20%) [31]. Một số nghiên cứu đã cố gắng tìm ra tác động của đột biến S18Y lên cấu trúc và chức năng của UCH-L1 cả in vitro và in vivo. Năm 2002, iu và cộng sự cho rằng UCH-L1 có khả năng hình thành dimer ubiquitin ngoài chức năng hydrolase của nó [21]. Đột biến S18Y có ắt ảnh hưởng lên hoạt động hydrolase nhưng nó được cho là làm giảm hoạt tắnh ligase. Một nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc của S18Y sử dụng tán xạ neutron góc nhỏ cho rằng cả hai dạng hoang dại và đột biến đều tạo dimer ở cùng nồng độ. Và khi so sánh với dạng hoang dại và I93M, S18Y có nhiều cấu trúc hình cầu hơn trong thể dimer cũng như trong dạng tinh thể. Gần đây, biểu hiện vượt mức S18Y cho thấy khả năng chống oxi hóa của các tế bào thần kinh. Gần đây nhất, 2011, Anderson và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu nữa (đo huỳnh quang, phổ UV và NMR) cho thấysự ổn định của S 8 tương tự dạng hoang dại nhưng không thấy có bằng chứng nào cho thấy
- 12 -
có sự hình thành dimer ở cả dạng đột biến và hoang dại, điều này trái ngược với Liu và cộng sự. Nhóm cũng cho rằng S18Y có hoạt động hydrolase tương tự dạng hoang dại và S 8 có độ ổn định thấp hơn dạng hoang dại một ắt, có thể do đột biến đã làm giảm nhẹ sự ổn định tuy nhiên ảnh hưởng rất t đến cấu trúc. Vì sự tương đồng giữa S18Y và dạng hoang dại, họ cho rằng không có bằng chứng để nói rằng S18Y góp phần làm giảm độ nhạy cảm đối với PD. Tuy nhiên khả năng này vẫn không bị loại trừ hoàn toàn và cần nhiều nghiên cứu mở rộng hơn nữa.
3.Bệnh Parkinson và con đường sinh tổng hợp dopamine 3.1.Con đường sinh tổng hợp dopamine
Dopamine được biết đến như một chất truyền tắn hiệu thần kinh hiện diện trong não của cả động vật có ương sống và động vật không ương sống. Chức năng này của dopamine được phát hiện năm 9 8 bởi Arvid Carlsson và Nils-Âke Hillarp, Thụy Điển.
Dopamine được tổng hợp chủ yếu từ hệ thần kinh vận động bao gồm vùng chất đen vùng vân, vùng dưới đồi, vùng vỏ não trước, vùng VTA (ventral tegmental area). Đầu tiên, amino acid L-tyrosine bị hydroxyl hóa thành L-DOPA nhờ enzyme tyrosine 3-monooxygenase, hay còn gọi là tyrosine hydro ylase. Sau đó, -DOPA bị decarboxyl hóa thành dopamine nhờ enzyme dopa decarboxylase. Trong một số tế bào thần kinh, dopamine tiếp tục được chuyển hóa thành norepinephrine và epinephrine. (hình 1.3).
- 13 -
Hình 3. n đường sinh tổng hợp dopamine
Trong tế bào, dopamine có thể bị thoái hóa bởi hai con đường. Ở hầu hết các vùng của não, dopamine bị bất hoạt bởi con đường tái hấp thu bởi dopamine transporter (D T sau đó bị chuyển đổi bởi hệ thống enzyme monoamine oxidase (MAOA và MAOB) thành 3,4-dihydroxyphenylacetic. Ở vùng vỏ não trước, do ở đây có rất ắt protein DAT1 nên dopamine bị bất hoạt nhờ norepinephrine transporter (NET) sau đó bị chuyển đổi bởi enzyme catechol-O-methyl trasferase thành 3- methoxytyramine (hình 1.4)
- 14 -
Hình 4. á n đường thoái hóa dopamine
3.2.Tyrosine hydroxylase (TH) và bệnh Parkinson
ene quy định protein tyrosine hydroxylase của người nằm trên nhiễm sắc thể số 11, từ 2. bp đến 2. bp. Năm 997, cấu trúc bậc ba của TH đã được tìm ra. Mỗi đơn phân chứa 14 xoắn alpha (49%) và 8 phiến beta (9%) cùng một vị trắ hoạt động và một vùng cấu trúc bậc bốn (tetramerization domain) [12].
Như đã nói trên, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nguyên nhân chắnh dẫn đến bệnh Parkinson là do sự thiếu hụt dopamine, do tế bào sinh dopamine bị thoái hóa hoặc giảm khả năng hình thành dopamine trong suốt quá trình sinh tổng hợp dopamine trong tế bào.
Vì tyrosine hydroxylase xúc tác hình thành L-DOPA, một bước trong quá trình sinh tổng hợp dopamine, nên có giả thiết cho rằng bệnh có thể phát sinh do hội chứng thiếu hụt TH trong vùng vân não. Tương tự, ở một số bệnh nhân mắc bệnh di truyền rối
- 15 -
loạn thần kinh vận động liên quan đến L-DOPA thì thấy có đột biến trên gen TH và giảm hoạt tắnh của TH [19], [23].
Một giả thuyết được đưa ra là TH là một nguồn tác động của các tác nhân oxi hóa in vitro dẫn đến tổn thương cấu trúc. Tất cả các tế bào vận động đều có khả năng bị hiện tượng stress oxy hóa dù chúng có rất nhiều các nhân tố bảo vệ. Trước hết, các tế bào này có rất nhiều dio ygen để sử dụng cho các hoạt động hô hấp ti thể tạo ATP và duy trì sự cân bằng năng lượng cho các tế bào thần kinh. Quá trình vận chuyển điện tử trong ti thể có thể sản sinh ra rất nhiều tác nhân o i hóa (ROS như H2O2 và O2-, những nhân tố này có thể tác động trực tiếp hay chuyển thành dạng ỜOH, gây ra những tổn thương o i hóa cho các đại phân tử trong tế bào (protein, lipid, carbohydrate, nucleic acid . Hơn nữa, [14] đã cho rằng enzyme mang nhân sắt có thể phản ứng với H202 v à O2- hình thành dạng ỜOH, trong khi đó TH là một enzyme thuộc dạng enzyme không có heme nhưng lại có vị trắ bám của sắt. Do đó, TH có nguy cơ bị thương tổn cấu trúc cao bởi tác động của các tác nhân oxi hóa .
Một số bằng chứng cho thấy sự suy giảm chức năng của TH khi bị đột biến (haploinsufficiency) có thể tăng khả năng gây bệnh Parkinson và các hội chứng suy giảm thần kinh vận động khác (dystonia) được kế đến như:
- Những nghiên cứu trên động vật cho thấy hoạt tắnh của enzyme TH giảm theo độ tuổi. Các nhà khoa học nhận thấy có sự tăng đáng kể (59%) nhóm carbonyl của enzyme TH trong SN của chuột 24 tháng tuổi so với chuột 4-12 tháng tuổi [5]. Điều này cho thấy lượng TH bị oxi hóa bởi các tác nhân ROS cao hơn ở những chuột già. Năm 2006, Hert và cộng sự nhận thấy ở một bệnh nhân Parkinson trẻ tuổi (36 tuổi) có một đột biến sai nghĩa ( 6T trên gen TH và lặp đoạn tại exon 11 trên gen parkin. Có thể tác động cộng gộp của hai đột biến này đã làm bệnh nhân mắc bệnh Parkinson khi tuổi còn rất trẻ .
- Một nhóm nghiên cứu cho rằng DJ-1, một protein có liên quan đến bệnh Parkinson, có khả năng điều hòa biểu hiện TH. Nhóm đã thực hiện knock-down DJ-1
- 16 -
trên dòng tế bào SH-SY5Y của người thì thấy có sự giảm biểu hiện TH, tuy nhiên khi tiến hành knock-down DJ-1 trên chuột thì lại không thấy có [30].
- Một số nghiên cứu tiến hành trên ruồi giấm cũng cho thấy khi sử dụng siRNA để bất hoạt gen DJ-1 thì có sự giảm biểu hiện TH. Do đó, khi DJ-1 bị rối loạn có thể ảnh hưởng tới sự biểu hiện của TH, từ đó làm giảm lượng dopamine hình thành trong não.
4.Nghiên cứu cơ chế bệnh trên mô hình ruồi giấm 4.1.Mô hình ruồi giấm
Mặc dù mô hình chuột chuyển gene đã và đang được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các bệnh trên người. Tuy nhiên, mô hình này thường tốn tiền và cần nhiều thời gian. Mặt khác, sau khi dự án bộ gen người đã được thực hiện hoàn tất, việc so sánh dữ liệu bộ gene của người và của ruồi giấm, Drosophila, cho thấy có khỏang 70% gene bệnh ở người có gene tương đồng và bảo tồn ở ruồi giấm [26]. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gene trong nghiên cứu bệnh ở người. Mô hình ruồi giấm chuyển gene cho phép nghiên cứu và mô phỏng một cách rõ ràng mạng lưới các gene liên quan, cơ chế điều hòa sự biểu hiện của gene gây bệnh. Mô hình này có ưu điểm:
Dễ nuôi, trong điều kiện phòng thắ nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho ruồi sống và phát triển là 25oC.
Ít tốn kém, có thể nhân lên với số lượng lớn mà không đòi hỏi nhiều không gian cũng như trang thiết bị.
òng đời ngắn, khoảng 10 ngày từ giai đoạn trứng đến ruồi trưởng thành (hình 1.5).
- 17 -
Hình 5. òng đời của ruồi giấm Drosophila melanogaster
Bộ gen đơn giản, gồm 4 cặp nhiễm sắc thể. Cặp nhiễm sắc thể số 1 là cặp nhiễm sắc thể giới tắnh (gồm 2 chiếc X ở con cái; 1 chiếc X, một chiếc Y ở con đực. Nhiễm sắc thể Y chứa toàn bộ dị nhiễm sắc, ch mang một ắt gen cần sự cho sự sinh sản của con đực).
Bộ gen đã được giải trình tự năm 2000, có 3600 gen, trong đó có tới 70% gen bệnh giống với con người [2]. Cơ sở dữ liệu phong phú, đa dạng, nhiều dòng ruồi đã được thiết kế kiểu gen với đầy đủ các thông tin cần thiết, giúp các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng thiết lập các thắ nghiệm. Các nguồn cơ sở dữ liệu lớn như: lybase (http://flybase.org) Bloomington, Indiana-Mỹ (http://flystocks.bio.indiana.edu/); Szeged, Hungary (http://expbio.bio.u-szeged.hu/); Kyoto, Nhật Bản (http://www.dgrc.kit.ac.jp/) và Ehime, Nhật Bản (http://kyotofly.kit.jp). Ngoài ra, tập hợp rất lớn các đoạn chèn của yếu tố P cũng được thiết lập tại các trường đại học như: Baylor, Texas (http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/pscreen/); Harvard, Massachussets (http://drosophila.med.harvard.edu/); Cambridge, Anh (http://www.drosdel.org.uk/). Một địa ch rất hữu ắch khác là Trung Tâm Nguồn Gen Drosophila (DGRC-Drosophila
- 18 -
Genomics Resource Center: http://dgrc.cgb.indiana.edu/) cung cấp thông tin về các dòng cDNA, dòng tế bào và microarray.
Ngoài ra Drosophila còn có rất nhiều công cụ hữu ắch giúp cho việc nghiên cứu di truyền học dễ dàng hơn như:
Hệ thần kinh đủ phức tạp (so với C.elegans để tiến hành những nghiên cứu về thần kinh cũng như hành vi có liên quan đến con người, nhưng cũng đủ nhỏ (so với chuột) cho những phân t ch đi sâu tìm hiểu về cấu trúc và chức năng.
Nhân tố P giúp chuyển gen mong muốn vào các dòng ruồi một cách dễ dàng.
Các nhiễm sắc thể cân bằng (balancer chromosome). Chúng chứa các đoạn lặp lại đảo ngược nhằm ngăn chặn tái tố hợp tương đồng trong giảm phân giúp duy trì sự ổn định của các gen. Thêm vào đó, chúng còn mang các đột biến trội với những kiểu hình dễ nhận biết (cánh th ng/cánh cong, có/không có lông ở các vị trắ khác nhau trên cơ thể ruồi, lông dài/lông ngắn, mắt trắng/mắt đỏẦ và các đột biến lặn gây chết hoặc không có khả năng sinh sản (khi xảy ra đồng hợp balancer).
Do vậy, mô hình ruồi giấm đã và đang được ứng dụng khá rộng rãi để nghiên cứu bệnh trên người [3], [25], [28]. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng mô hình này để nghiên cứu cơ chế phát sinh, sàng lọc các gene liên quan, nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc thuốc trị bệnh. Các bệnh được nghiên cứu thành công trên mô hình ruồi giấm bao gồm: ung thư, bệnh tim mạch, bệnh thóai hóa thần kinh, bệnh về trao đổi chất v..vẦv.. [4], [9]. Các nhà khoa học Hàn Quốc đã khám phá dDuox có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, ngăn ngừa sự xâm nhiễm của vi khuẩn [13]. Các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc thiết kế các mô hình ruồi giấm cho nghiên cứu các bệnh rối lọan chức năng cơ (muscular dysophy , bệnh leukemia và bệnh thoái hóa thần kinh poly-Q (neurodegenerative poly glutamine) [16], [22], [32]. Sử dụng mô hình ruồi giấm, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã tìm thấy sự liên quan giữa beta-sarcoglycan trong con đường truyền tắn hiệu EGFR [15] và đã tìm ra một chất phân tử lượng nhỏ có khả năng sẽ được sử dụng làm thuốc chữa bệnh poly-Q [9].
- 19 -