3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.6. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Có rất nhiều phương pháp có thể dùng để xác định độc tố đường ruột (Enterotoxin) và kháng nguyên bám dính (Fimbriae) của vi khuẩn E. coli. Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các loại độc tố và kháng nguyên bám dính, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhậy và tính chính xác của nó.
- Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần có sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Vì vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Điều đó có nghĩa là để khuyếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Từ xuôi và ngược được hiểu là xuôi và ngược so với chiều phiên mã của gen.
* Cách tiến hành:
- DNA mẫu: khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37o
C/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm
Primers: 1 l mỗi loại
Dung dịch đệm (5X): 5.0 l
Enzyme (Taq polymerase): 0.05 l
Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 l cho 1 phản ứng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chu trình của phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer.
- Chạy điện di: sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) 0với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - Acetic - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1 l/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.
- Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.