3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tình hình chăn nuôi và dịch bệnh tại tỉnh Vĩnh Phúc
2.2.2. Điều tra tình hình lợn con mắc bệnh tiêu chảy trong năm 2012 tại 3 huyện Lập Thạch, Tam Dương và Tam Đảo của Tỉnh Vĩnh Phúc
2.2.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng E. coli phân lập được
2.2.4. Xác định serotype kháng nguyên O, K của các chủng E. coli
phân lập được.
2.2.5. Xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy.
2.2.6. Kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch. 2.2.7. Kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn E. coli phân lập được.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.8. Nghiên cứu biện pháp phòng, trị bệnh tiêu chảy cho lợn con nuôi tại 3 huyện của Tỉnh Vĩnh Phúc.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Trong điều tra dịch tễ học bệnh tiêu chảy ở lợn con trên địa bàn 3 huyện của tỉnh Vĩnh Phúc, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu về dịch tễ học như: Thống kê, mô tả, phân tích và tổng hợp.
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli trên môi trường nuôi cấy
(Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định tính chất sinh vật, hoá học, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli theo phuơng pháp thường quy của Bộ môn Vi trùng Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương)
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành thí nghiệm
Chọn khuẩn lạc
Mẫu phân, bệnh phẩm từ lợn nghi mắc bệnh
Môi trường thạch máu MacConkey
Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Thạch máu Giám định vi khuẩn E. coli Phản ứng PCR Phát hiện các yếu tố gây bệnh Xác định Serotype kháng nguyên Thử kháng sinh đồ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Cách lấy mẫu bệnh phẩm:
+ Mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy phân trực tiếp từ trực tràng của lợn nghi nhiễm E. coli, cho vào lọ có chứa môi trường bảo quản, giữ trong thùng bảo ôn và gửi nhanh về phòng thí nghiệm.
+ Mẫu phủ tạng: Sau khi mổ khám, cắt một phần tổ chức tim, gan, lách, hạch ruột, phổi cho vào từng lọ riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong thùng bảo ôn và gửi nhanh về phòng xét nghiệm.
+ Mẫu máu: Dùng bơm tiêm lấy 03 ml máu từ vịnh tĩnh mạch cổ sau khi đã sát trùng cẩn thận, chia vào 02 ống Eppendorf, đậy kín, để yên cho đến khi máu đông, cho vào thùng bảo ôn và gửi nhanh về phòng thí nghiệm. Tất cả các loại mẫu đều được ghi chép đầy đủ các thông tin trên phiếu bệnh phẩm và nhãn bệnh phẩm, đảm bảo giống nhau giữa nhãn và phiếu bệnh phẩm.
- Cách xử lý bệnh phẩm: Cắt một mẫu bệnh phẩm phía trong, dùng panh kẹp vô trùng ria cấy trực tiếp lên thạch đĩa hoặc đem nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch với nước sinh lý theo tỷ lệ1/10 rồi dùng ống hút cấy vào thạch máu, thạch thường, thạch MacConkey, bồi dưỡng tủ ấm 370
C trong 24 giờ. Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc màu hồng, tròn, nhỏ, rìa gọn hơi lồi, không nhầy, đường kính khuẩn lạc 1,5 - 2 mm. Sau đó chọn những khuẩn lạc thuần điển hình, đứng riêng rẽ cấy chuyển sang thạch máu và nước thịt giữ giống để tiến hành giám định kiểm tra.
2.3.3. Phương pháp xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli
Các phản ứng sinh hoá học dùng để xác định phân biệt vi khuẩn E. coli như:
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.3.3.1. Phản ứng sinh Indol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3.2. Phản ứng VP (Voges Proskauer) 2.3.3.3. Phản ứng lên men sinh hơi đường 2.3.3.4. Phản ứng urea
2.3.3.5. Phản ứng sinh H2S
Theo phương pháp thường quy được sử dụng trong phòng thí nghiệm của bộ môn Vi trùng-Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương.
2.3.4. Xác định serotype kháng nguyên O vi khuẩn E. coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính ngưng kết nhanh trên phiến kính
Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli
phân lập được, chúng tôi tiến hành xác định serotype bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Vì kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli có rất nhiều serotype bởi vậyngười ta thường sản xuất các nhóm kháng huyết thanh O, mỗi nhóm gồm một số serotype, đồng thời cùng sản xuất các kháng huyết thanh đơn giá. Muốnxác định serotype vi khuẩn E. coli phải tiến hành xác định nhóm với kháng huyết thanh nhóm, sau đó mới xác định serotype với kháng huyết thanh đơngiá thuộc nhóm kháng huyết thanh đa giá đã ngưng kết.
* Cách tiến hành: Trên một phiến kính sạch, nhỏ hai giọt nước muối sinh lý ở hai đầu. Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc E. coli cần xác định serotype mọc trên thạch máu hoà tan vào hai giọt nước muối sinh lý ở haiđầu của phiến kính.
Dùng que cấy vô trùng lấy kháng huyết thanh đa giá nhóm trộn vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, trộn đều. Còn huyễn dịch vi khuẩn bên kia không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1-2 phút nhiệt độ phòng, đọc kết quả phản ứng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Phản ứng dương tính: khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn có những hạt ngưng kết, mức độ ngưng kết được đánh giá từ 1+ đến 4+.
+ Phản ứng âm tính: Phần huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn đục đều không có hạt ngưng kết xuất hiện bên đối chứng âm.
Chọn những lạc có ngưng kết với kháng huyết thanh đơn giá nhóm, tiến hành làm ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm như đã tiến hành với nhóm đa giá. Nừu một vi khuẩn ngưng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng thể đơn giá thì phải pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo cấp số 2(1/2; 1/4, 1/8.... 1/64) rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng. Serotype nào ngưng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh coa nhất đó là serotype của vi khuẩn.
2.3.5. Xác định kháng nguyên K88 bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính phiến kính
- Chuẩn bị: Giống vi khuẩn E. coli cần xác định kháng nguyên K88
Kháng thể K88 chuẩn
Phiến kính sạch, nước muối sinh lý
- Tiến hành phản ứng: Nhỏ hai giọt nước muối sinh lý lên hai đầu phiến kính sạch, dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần xác định từ khuẩn lạc thuần mọc trên thạch máu hoặc thạch MacConkey hoà vào giọt nước muối sinh lý. Dùng ống hút hoặc que cấy lấy một giọt kháng thể chuẩn trộn vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, bên còn lại dùng đối chứng âm. Đọc kết quả sau 30 giây.
+ Phản ứng dương tính: Khi hình thành những hạt lấm tấm (ngưng kết) + Phản ứng âm tính: Giọt huyễn dịch đục đều như giọt đối chứng.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Có rất nhiều phương pháp có thể dùng để xác định độc tố đường ruột (Enterotoxin) và kháng nguyên bám dính (Fimbriae) của vi khuẩn E. coli. Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các loại độc tố và kháng nguyên bám dính, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhậy và tính chính xác của nó.
- Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần có sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Vì vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Điều đó có nghĩa là để khuyếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Từ xuôi và ngược được hiểu là xuôi và ngược so với chiều phiên mã của gen.
* Cách tiến hành:
- DNA mẫu: khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37o
C/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm
Primers: 1 l mỗi loại
Dung dịch đệm (5X): 5.0 l
Enzyme (Taq polymerase): 0.05 l
Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 l cho 1 phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chu trình của phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer.
- Chạy điện di: sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) 0với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - Acetic - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1 l/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.
- Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.
2.3.7. Thử nghiệm các biện pháp phòng, điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con do vi khuẩn E. coli gây ra do vi khuẩn E. coli gây ra
Từ kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn một số phác đồ để điều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
+ Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc.
+ Trên cơ sở kết quả kiểm tra sự mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập được với các loại kháng sinh, lập phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ.
+ Xây dựng biện pháp tổng hợp để phòng bệnh và điều trị lợn mắc bệnh bằng thuốc kháng sinh.
- Căn cứ vào kết quả xác định các yếu tố gây bệnh có trong các chủng
E. coli phân lập được cho thấy các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được phù hợp với những yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli dùng để chế vác xin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con ở Bộ môn Vi Trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương
- Trên cơ sở kết quả kiểm tra sự mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập được với các loại kháng sinh, lập phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel.
2.4. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
2.4.1. Mẫu bệnh phẩm
- Phân của lợn con theo mẹ bị tiêu chảy
- Gan, lách, ruột của lợn con bị tiêu chảy vừa chết hoặc sắp chết
2.4.2. Các loại môi trường, hoá chất
- Các loại môi trường thông thường và đặc hiệu dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn đường ruột, bao gồm: thạch máu, thạch MacConkey, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton, và các loại môi trường đường Glucose, Lactose, Mannitol... do hãng Oxoid của Anh sản xuất.
- Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid.
- Kháng huyết thanh chuẩn của Úc dùng để định typ vi khuẩn E. coli
phân lập được
- Các hoá chất và dụng cụ phòng thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu vi khuẩn.
2.4.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lượng trung bình 18 - 20 g/con dùng để thử độc lực của vi khuẩn
2.4.4. Các loại hoá chất môi trường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nước thịt - Thạch máu
- Thạch MacConkey - Môi trường BHI
- Môi trường thử kháng sinh đồ (Mueller - Hinton dạng thạch và dạng lỏng). Các loại môi trường trên do hãng Oxoid (Anh) sản xuất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Các loại hoá chất và môi trường thử phản ứng lên men đường thông thường trong phòng thí nghiệm: Lactose, Sucrose, Dulcitol, Salicin, Sorbitol, Arabinose, Raffinose, Mannitol, Rhamnose, Xylose, Maltose, Trehalose
- Thuốc nhuộm Gram - Dung dịch PBS - Dung dịch Kovac - Dung dịch Andrader
- Các loại đĩa giấy kháng sinh do hãng Oxoid. - Các loại kháng sinh, chế phẩm sinh học.
2.3.5. Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn E. coli phân lập được lập được
- Kháng huyết thanh chuẩn định Type kháng nguyên O đa giá và đơn giá. - Kháng huyết thanh K88 và K99 chuẩn
2.4.6. Các loại hoá chất và môi trường dùng trong phản ứng PCR
2.4.6.1. Các hoá chất và dung dịch cần cho phản ứng PCR
- AMP x 5 buffer
- Dung dÞch MgCl2 stock
- DNTP stocks - PCR x 10 buffer - Primer
2.4.6.2. Các dung dịch và hoá chất cần cho bước chạy điện di
- 50 x TAE - 0,5 M (EDTA) - Loading buffer
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.6.4. Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương và đối chứng âm cho phản ứng PCR bao gồm
FD520 (F6); (09:K99); FD617 (F4); FD634 (LT STa STb K88); FD638 (LT STb K88); FD527 (negative control)
2.4.7. Máy móc thiết bị
- Buồng cấy vô trùng - Nồi hấp ướt
- Máy ly tâm - Máy lắc giàn
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tình hình chăn nuôi và dịch bệnh ở Vĩnh Phúc
3.1.1. Tình hình chăn nuôi gia súc, gia cầm
Tỉnh Vĩnh Phúc là vùng đồng bằng có trung du và miền núi, phía bắc giáp tỉnh Thái Nguyên và tỉnh Tuyên Quang, phía Tây giáp tỉnh Phú Thọ, phía Đông và phía Nam giáp Thủ đô Hà Nội. Vĩnh phúc thuộc vùng kinh tế trọng điểm Bắc bộ vùng Thủ đô Hà Nội. Tổng diện tích tự nhiên gần 1.300Km2 dân số trên 1,1 triệu người; Vĩnh phúc nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm; nhiệt độ trung bình hàng năm 23,20C. Vĩnh Phúc có nguồn nhân lực dồi dào, có tiềm năng phát triển nông nghiệp và trong đó rất trú trọng trong phát triển chăn nuôi.
Bảng 3.1: Số lƣợng gia súc, gia cầm tỉnh Vĩnh Phúc từ 2008 - 2012