2.5.1. Cám gạo
Cám gạo là sản phẩm phụ của quá trình xay xát và chế biến gạo. Cám gạo có giá trị dinh dưỡng khá cao. Cám được thu hồi dưới 2 dạng là cám thô và cám ướt. Chúng thường có dạng bột, màu hơi vàng, mềm và mịn, chiếm khoảng 10-12% khối lượng lúa chưa xay xát. Trong 100 g cám gạo có khoảng 28 g tinh bột, vì vậy đây là nguồn cơ chất khá lí tưởng để dùng trong lên men bán rắn thu nhận amylase từ các vi sinh vật do nguồ cung ổn định, giá thành rẻ và có lượng tinh bột khá cạo
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo
Thành phần Khối lượng/100g
Calori 316 KJ
Tổng số lipit 21g
Chất béo bảo hòa 4 g
Chất xơ tiêu hóa được 21g
Carbohydrat 28 g Đường 0,9 g Protein 13,3 g Vitamin E 4,9 mg Vitamin B6 4,1 mg Canxi 57 mg Kali 20 mg (http://www.nutritiondata.com/).
Theo bảng trên thì cám có lượng dinh dưỡng rất cao với lượng chất béo chưa bão hoà cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, can xi, kali đều rất cao, ngoài ra trong cám còn có chức chất béo omega 3 khá cao. Theo nhiều nghiêu cứu cho thấy 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám, thành phần của cám có nhiều loại vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu nên có thể xem là nguồn lương thực rất tốt cho cả con người.
Tuy nhiên cám thường được cho các loại gia súc và thủy sản ăn chứ không cho người. Nguyên nhân là do cám có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh sẽ oxy hóa các nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó chịu. Thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo chưa cao, lại ít được đầu
tư theo hướng thu cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá vân vân). Vì lý do đó mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng nuôi các loại gia súc, gia cầm. Hàng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu tấn cám được sản suất và 90% là nằm ở châu Á (http://www.bannhanong.com/, xử lý cám gạo để thay thế ngũ cốc).
2.5.2. Bã đậu nành
Bã đậu nành có hàm lượng xơ cao, bao gồm chất xơ hoà tan và chất xơ không hoà tan. Chất xơ không hoà tan có tác động chống táo bón, ngăn ngừa ung thư ruột kết, ung thư đại tràng, giảm nguy cơ trĩ, chống béo phì và bệnh tiểu đường.
Chất xơ hoà tan có khả năng tan trong nước thành dung dịch keo. Khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thụ một số chất có hại như cholesterol vào máu. Ngoài ra, trong bã đậu nành còn có chất isoflavones có khả năng phòng chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), lượng chất xơ sử dụng mỗi ngày nên đảm bảo 27 – 40 g xơ tổng, 16 – 27 g xơ không hoà tan.
Tuy nhiên, trong thực tế bã đậu nành khó xay mịn và có cấu trúc nhám, rời rạc nên không thể dùng trong chế biến thực phẩm. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã dùng phương pháp vi sinh để xử lý bã đậu nành. Họ đã dùng hai loại enzyme (men) có tên là Pectinase và Cellulase với tỷ lệ thích hợp để thủy phân bã đậu nành. Nhờ đó, đã giúp bã đậu nành qua xử lý trở nên mịn và làm thay đổi hàm lượng các hợp chất xơ trong bã đậu nành theo cách có lợi nhất (http:// www.Vietnamnet.com).
2.6. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme
Hiện nay trên thế giới chủ yếu áp dụng hai phương pháp sản xuất enzyme là nuôi cấy bề mặt (lên men bán rắn) và nuôi cấy chìm.
2.6.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường đặc (còn gọi là môi trường len men bán rắn), nhưng chủ yếu vẫn là nuôi cấy trên môi trường đặc. Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme thường sử dụng môi trường đặc để nuôi cấy thu nhận enzyme từ vi sinh vật.
Môi trường lên men bán rắn thường dùng nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, cám mì, bã đậu nành, ngô mảnh,… Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất khác nhau và một số thành phần khác cho thích hợp.
Khi nuôi cấy theo phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường, rồi sinh tổng hợp ra enzyme ngoại bào và nội bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng và hoạt tính enzyme cao, chế phẩm dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần sử dụng những thiết bị đặc biệt, tiêu thụ năng lượng ít nên có thể áp dụng ở nhiều địa phương. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tốn diện tích mặt bằng và đòi hỏi lượng nhân công lớn, khó cơ giớ hóa trong sản xuất.
Ưu điểm khác của phương pháp này là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác, thường chỉ xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ nên dễ xử lí. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa.
2.6.2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Còn gọi là phương pháp nuôi cấy bề sâu. Phương pháp này vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng và được nuôi trong các thùng lên men. Các thiết bị lên men được lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp õi, hệ thống điều chỉnh pH và nông độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tùy theo chủng loại vi sinh vật mà thành phần của môi trường lỏng sẽ được thay đổi cho thích hợp.
Phương pháp này được dùng phổ biến trong lên men qui mô công nghiệp. So với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy chìm ít choáng diện tích bề mặt, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho trang thiết bị.
Phương pháp này có ưu điểm là dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít tốn diện tích, song chúng đòi hỏi sự đầu tư lớn, khó được thực hiện ở nhiều nơi, và sẽ rất khó khăn trong việc xử lí sự xâm nhập của các vi sinh vật lạ.
2.7. Thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt 2.7.1. Trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Enzyme ngoại bào sẽ tồn tại trong tế bào vi sinh vật với hàm lượng rất thấp so với các thành phần khác. Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được không chỉ enzyme hòa tan trong nước mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất môt trường và các chất do nấm mốc tạo ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
Các enzyme thường là những chất hữu cơ không bền dễ bị biến tính khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Do đó, việc tách và thu nhận enzyme là điều không dễ.
Để chiết rút enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính hay các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó, nước thường được dùng nhiều nhất vì sự thuận tiện và cho kết quả cao. Enzyme từ môi trường khuếch tán vào nước do sự chênh lệch nồng độ. Nước có thể chiết tách 90 – 95% enzyme trong canh trường. Nước thường dùng chiết tách có nhiệt độ 25 - 280C.
Trong quá trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường bán rắn, các vật chất khô trong môi trường sẽ bị hòa tan thủy phân khoảng 33 - 35%, tinh bột sẽ bị thủy phân hoàn toàn và trong môi trường sẽ còn lại phần đường mà sinh vật chưa sử dụng hết.
2.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích
Tỉ lệ nước có ảnh hưởng rất lớn đến sự thu nhận ezyme từ canh trường nuôi cấy vi sinh vật. Canh trường khô cần nhiều nước để trích li enzyme hơn canh trường ẩm. Với các tỉ lệ nước: canh trường nuôi cấy khác nhau ta sẽ thu được những lượng enzyme khác nhau. Thường lượng nước dùng li trích gấp 3 – 3,5 lần so với lượng canh trường nuôi cấy nấm mốc.
Tiếp đến là sự ảnh hưởng của thời gian li trích. Enzyme thủy phân dễ dàng hòa tan vào nước, thời gian trích li càng lâu càng có khả năng trích li được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính enzyme.
Khi nhiệt độ trích li càng tăng thì vận tốc trích li cũng tăng theo nhưng cũng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết làm giảm hiệu suất trích enzyme và giảm hoạt tính của enzyme. Nhiệt độ trích li tối thích là từ 28 – 300C. Trong công nghiệp nước máy với pH 7 thường được dùng để li trích enzyme.
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009, tại phòng các chất có hoạt tính sinh học – Viện sinh học nhiệt đới.
3.2. Vật liệu thí nghiệm3.2.1. Đối tượng thí nghiệm 3.2.1. Đối tượng thí nghiệm
Nấm mốc Aspergillus niger và Mucor do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA ở nhiệt độ thường là 300C trong thời gian 2 - 3 ngày, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 40C.
3.2.2. Cơ chất
Cơ chất sử dụng trong đề tài bao gồm lúa, cám gạo, trấu và bã đậu nành. Lúa, cám gạo, trấu được mua ở chợ Thủ Đức, cám phải tương đối xốp dễ thông khí, không có mùi ôi. Bã đậu nành được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Các cơ chất sẽ được phối trộn với nhau trong môi trường nuôi cấy.
3.2.3. Hóa chất và thiết bị 3.2.3.1. Hóa chất
Hóa chất pha thuốc thử Lugol, hóa chất pha môi trường Czapeck, môi trường Zapeck, hóa chất pha môi trường PGA, môi trường dinh dưỡng Mandel, hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein, bao gồm dung dịch Abumin chuẩn và thuốc thử Bradford, hóa chất dùng chỉnh pH cho môi trường dinh dưỡng (HCl 0,1M, NaOH 0,1M), cồn 700
, 900, tinh bột tan và dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5.
3.2.3.2. Thiết bị
Các thiết bị gồm có cân phân tích, bể ổn nhiệt, phòng đếm hồng cầu, kính hiển vi quang học Olympus, nồi hấp Tommy-SS-325, máy xay sinh tố, máy khuấy từ, tủ lạnh, máy đo pH, máy đo quang phổ UV-Vis cùng các dụng cụ phòng thí nghiệm như que cấy, pipet, pipetman, ống nghiệm, ống đong, becher, erlen, vân vân.
3.3. Phương pháp nghiên cứu3.3.1. Phương pháp cấy truyền 3.3.1. Phương pháp cấy truyền
Do cả hai loại nấm trên đều sinh sản bằng bào tử nên ta sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, bằng cách cấy theo đường dích dắc. Khi
khuẩn lạc mọc đều sẽ cho vào tủ lạnh giữ ở nhiệt độ 5 - 90C để tránh nấm mốc bị già làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau.
Đầu tiên, cân 50g khoai tây, 5 g agar, 5 g glucose. Khoai tây rửa sạch gọt vỏ, cắt lát mỏng đem cân, cho vào nồi đun sôi với 250 ml nước cất trong khoảng 30 phút. Tiến hành lọc qua vải lọc, lấy phần nước trong, cho thêm nước cất vừa đủ 250 ml, cho agar và glucose vào đun sôi đến khi tan hết.
Sau đó tiến hành tạo môi trường thạch nghiêng. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, khoảng 1/4 chiều cao ống nghiệm. Làm nút bông và bao gói hấp khử trùng ở 1210C và 1 atm, trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, thạch trong ống nghiệm còn lỏng ta để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến khi thạch đông đặc hoàn toàn. Vị trí nghiêng phải để đầu trên của mặt nghiêng không vượt qua 2/3 chiều dài ống nghiệm, không được để thạch chạm vào nút bông, mặt thạch bằng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải không quá ngắn hoặc quá dài.
Tiếp theo sẽ thực hiện việc cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Dùng que cấy móc đã khử trùng cấy truyền giống từ ống giống sang các ống nghiệm đã chuẩn bị ở trên. Động tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để bào tử phát triển ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày, bào tử mọc đều, rồi chuyển vào tủ lạnh trữ ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau.
3.3.2. Phương pháp nhân giống cấp 2 (giữ giống trên môi trường lúa)
Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm và pha môi trường dinh dưỡng, cồn và các ống nghiệm giống A. niger và Mucor. Dụng cụ thí nghiệm cần thiết cho các thí nghiệm này bao gồm becher, ống đong, ống nghiệm, đũa khuấy, que cấy và pipet đã khử trùng, erlen. Từ các dung dịch stock tiến hành pha dung dịch môi trường dinh dưỡng gồm có môi trường Mandel và Czapeck, chỉnh về pH 6. Thêm nước cất với tỉ lệ thích hợp để môi trường nhân giống đạt độ ẩm 55%.
Tiến hành cân 20g lúa cho vào 4 erlen, bổ sung thành phần khoáng đã chuẩn bị ở trên. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi môi trường. Sau đó đem các erlen hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Để nguội. Thực hiện cấy giống trong tủ vô trùng. Dùng pipetman hút 1 ml nước cất đã được vô trùng cho vào ống nghiệm chứa giống, dùng que cấy vòng hòa bào tử nấm mốc trong nước. Sau đó chuyển vào trong erlen. Tiến hành tương tự cho cả 4 erlen. Khuấy đều, đánh tơi bào tử của mốc giống vừa cấy vào môi trường bằng đũa thủy tinh vô trùng. Đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày quan sát
thấy lượng bào tử mọc nhiều, đem các erlen cho vào trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau.
3.3.3. Phương pháp mô tả hình thái A. niger và Mucor
3.3.3.1. Quan sát hình thái đại thể
Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ bào tử đính của nấm sợi, chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã vô trùng và để nguội, cắm đầu móc xuống mặt thạch thành 3 điểm. Các động tác trên được thực hiện trong tủ cấy. Sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 2 ngày. Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng và màu sắc).
3.3.3.2. Quan sát hình thái vi thể
Làm phòng ẩm để quan sát hình thái vi thể. Lót giấy thấm ở đáy petri (đường kính 12 cm) rồi đặt vào miếng lame, gói giấy và đem khử trùng. Nấu chảy môi trường PGA (vô trùng) rót chảy dọc theo nửa tấm lame và chờ đông lại, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng (vừa đủ ướt tờ giấy). Cấy một ít bào tử thành một hoặc hai điểm trên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 đến 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi hộp petri và quan sát. Quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 40 và 100 lần) hình dạng vi thể của hai chủng thí nghiệm.
Đầu tiên dùng que cấy hình móc câu một ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến kính. Tiếp theo cho vài giọt cồn 95% để một lúc, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên, đem soi. Hoặc cho vài giọt cồn 600 có vết amoniac, thấm khô rồi cho thêm vài giọt glycerin loãng lên tấm lame, đậy lá kính lên, đem soi. Mục đích của các tác dụng trên là tăng cường khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát.
3.3.4. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc). Người ta thường dùng 2 loại buồng đếm hồng cầu; buồng đếm Thomas