3.3.1. Phương pháp cấy truyền
Do cả hai loại nấm trên đều sinh sản bằng bào tử nên ta sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, bằng cách cấy theo đường dích dắc. Khi
khuẩn lạc mọc đều sẽ cho vào tủ lạnh giữ ở nhiệt độ 5 - 90C để tránh nấm mốc bị già làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau.
Đầu tiên, cân 50g khoai tây, 5 g agar, 5 g glucose. Khoai tây rửa sạch gọt vỏ, cắt lát mỏng đem cân, cho vào nồi đun sôi với 250 ml nước cất trong khoảng 30 phút. Tiến hành lọc qua vải lọc, lấy phần nước trong, cho thêm nước cất vừa đủ 250 ml, cho agar và glucose vào đun sôi đến khi tan hết.
Sau đó tiến hành tạo môi trường thạch nghiêng. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, khoảng 1/4 chiều cao ống nghiệm. Làm nút bông và bao gói hấp khử trùng ở 1210C và 1 atm, trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, thạch trong ống nghiệm còn lỏng ta để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến khi thạch đông đặc hoàn toàn. Vị trí nghiêng phải để đầu trên của mặt nghiêng không vượt qua 2/3 chiều dài ống nghiệm, không được để thạch chạm vào nút bông, mặt thạch bằng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải không quá ngắn hoặc quá dài.
Tiếp theo sẽ thực hiện việc cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Dùng que cấy móc đã khử trùng cấy truyền giống từ ống giống sang các ống nghiệm đã chuẩn bị ở trên. Động tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để bào tử phát triển ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày, bào tử mọc đều, rồi chuyển vào tủ lạnh trữ ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau.
3.3.2. Phương pháp nhân giống cấp 2 (giữ giống trên môi trường lúa)
Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm và pha môi trường dinh dưỡng, cồn và các ống nghiệm giống A. niger và Mucor. Dụng cụ thí nghiệm cần thiết cho các thí nghiệm này bao gồm becher, ống đong, ống nghiệm, đũa khuấy, que cấy và pipet đã khử trùng, erlen. Từ các dung dịch stock tiến hành pha dung dịch môi trường dinh dưỡng gồm có môi trường Mandel và Czapeck, chỉnh về pH 6. Thêm nước cất với tỉ lệ thích hợp để môi trường nhân giống đạt độ ẩm 55%.
Tiến hành cân 20g lúa cho vào 4 erlen, bổ sung thành phần khoáng đã chuẩn bị ở trên. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi môi trường. Sau đó đem các erlen hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Để nguội. Thực hiện cấy giống trong tủ vô trùng. Dùng pipetman hút 1 ml nước cất đã được vô trùng cho vào ống nghiệm chứa giống, dùng que cấy vòng hòa bào tử nấm mốc trong nước. Sau đó chuyển vào trong erlen. Tiến hành tương tự cho cả 4 erlen. Khuấy đều, đánh tơi bào tử của mốc giống vừa cấy vào môi trường bằng đũa thủy tinh vô trùng. Đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày quan sát
thấy lượng bào tử mọc nhiều, đem các erlen cho vào trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau.
3.3.3. Phương pháp mô tả hình thái A. niger và Mucor
3.3.3.1. Quan sát hình thái đại thể
Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ bào tử đính của nấm sợi, chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã vô trùng và để nguội, cắm đầu móc xuống mặt thạch thành 3 điểm. Các động tác trên được thực hiện trong tủ cấy. Sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 2 ngày. Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng và màu sắc).
3.3.3.2. Quan sát hình thái vi thể
Làm phòng ẩm để quan sát hình thái vi thể. Lót giấy thấm ở đáy petri (đường kính 12 cm) rồi đặt vào miếng lame, gói giấy và đem khử trùng. Nấu chảy môi trường PGA (vô trùng) rót chảy dọc theo nửa tấm lame và chờ đông lại, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng (vừa đủ ướt tờ giấy). Cấy một ít bào tử thành một hoặc hai điểm trên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 đến 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi hộp petri và quan sát. Quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 40 và 100 lần) hình dạng vi thể của hai chủng thí nghiệm.
Đầu tiên dùng que cấy hình móc câu một ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến kính. Tiếp theo cho vài giọt cồn 95% để một lúc, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên, đem soi. Hoặc cho vài giọt cồn 600 có vết amoniac, thấm khô rồi cho thêm vài giọt glycerin loãng lên tấm lame, đậy lá kính lên, đem soi. Mục đích của các tác dụng trên là tăng cường khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát.
3.3.4. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc). Người ta thường dùng 2 loại buồng đếm hồng cầu; buồng đếm Thomas và buồng đếm Goriep. Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại buông đếm này đều giống nhau. Buồng đếm đều là 1 phiến kính hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô vuông có diện tích là 1/25 mm2 lại được chia thành các ô nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10.
Tiến hành cân 1 g canh trường lấy từ canh trường nhân giống cấp 2 đã thực hiện trong mục 3.3.2 đem đi pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…. Sau đó tiến hành đếm trên phòng đếm.
Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch sinh lí chứa Tween 80 0,1% vô trùng và một số ống hút 1 ml vô trùng để tiến hành việc pha loãng mẫu. Cân 1 g bào tử nấm sợi cho vào ống nghiệm số 1 chứa 9 ml dung dịch muối sinh lí chứa Tween 80 0,1% vô trùng, huyền phù đều. Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1. Sau đó lại hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống số 2, trộn đều, ta được độ pha loãng 1/1000 hay10-2. Tiếp tục như vậy từ ống 2 sang ống 3, ống 3 sang ống 4. Ta sẽ được các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4.
Đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. Lắc đều ống nghiệm pha loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho vài giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để hình thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 - 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong năm ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô nhỏ và những bào tử nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16.
Chú ý nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm được trong 5 ô lớn phải lớn hơn 200 và phải đảm bảo được độ chính xác của phương pháp. Sau khi sử dụng xong buồng đếm phải được rửa ngay và lau thật khô để bảo quản.
Kết quả đếm được tính theo công thức như bên dưới. Công thức :
a*4000*103*n
b
N : số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù. a : số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con). b : số ô con trong năm ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô). 103 : số đổi mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml). n : độ pha loãng của mẫu.
3.3.5. Phương pháp xác định độ ẩm
Công thức tính độ ẩm
F = A*(B% - C%) / 100%. Cách tính độ ẩm % :
Ví dụ: Ta có 100 g cơ chất có độ ẩm 10% nhưng cần độ ẩm 50%. Theo công thức trên ta có:
100*(50 – 10) 100
Như vậy: trong 10g cơ chất ta bổ sung thêm 40ml nước cất sẽ được độ ẩm 50%. Với :
A : khối lượng cơ chất có trong môi trường nuôi cấy (g). B : độ ẩm muốn bổ sung vào môi trường (%).
C : độ ẩm trong cơ chất (%) ( với cơ chất là lúa, cám gạo, bã đậu nành, trấu thì độ ẩm thông thường của chúng là 10%). (Trần Anh Tuấn, 2005).
100 : độ ẩm 100%.
F : lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml).
3.3.6. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase
Phối trộn cám: trấu: bã đậu nành theo tỉ lệ (phụ thuộc vào từng giai đoạn của đề tài), cân 20g hỗn hợp cho vào mỗi erlen. Từ những dung dịch stock tiến hành pha môi trường dinh dưỡng gồm cả môi trường Mandel và Zapeck. Tiến hành điều chỉnh theo độ ẩm, pH, nồng độ môi trường theo từng thí nghiệm. Cho dung dịch dinh dưỡng vào các erlen chuẩn bị ở trên, đánh tơi. Khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút,sau đó làm nguội môi trườn.
Cân 1 g canh trường lúa từ các erlen trong mục 3.3.2, cho thêm 3 ml nước cất vào, khuấy bằng đũa khuấy vô trùng. Tiến hành đếm bào tử, pha loãng để đạt được lượng bào tử mỗi loại là 0,8*108 bào tử/g canh trường.
Chuyển huyền phù bào tử của nấm mốc trên vào các bình tam giác đã được chuẩn bị như trên, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp tùy theo từng thí nghiệm. Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme, nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường có tỉ lệ bã đậu nành: cám mì: cám gạo khác nhau (1:2:1, 2:1:1, 1:1:2), độ ẩm môi trường (từ 40 - 75%), pH (từ 3 - 8), nồng độ dinh dưỡng (x1 - x8 hay từ 1 - 8lần), tỉ lệ giống (từ 0,8*108 đến
3,2*108 bào tử/g môi trường), thời gian nuôi cấy (từ 8 đến 44 giờ) và yếu tố cuối cùng là nhiệt độ nuôi cấy (từ 30 - 550C).
Sau quá trình nuôi cấy, tiến hành li trích enzyme từ canh trường với dung môi là nước cất. Bổ sung nước cất với tỷ lệ 1 g canh trường: 3 g nước cất, khuấy trong 40 phút, lọc thu dịch chiết enzyme.
3.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng amylase
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại ở 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Đặc biệt nếu có mặt các acid amin nhân thơm sẽ bắt màu mạnh hơn. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hoá chất bao gồm dung dịch mẫu protein (cụ thể trong bài này là dịch chiết enzyme amylase thu từ các canh trường nuôi cấy), dung dịch albumin 0,1 mg/ml và dung dịch thuốc thử Bradford. Pha dung dịch albumin bằng cách cân chính xác 10 mg albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở nhiệt độ lạnh 200C, khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml. Sau đó tiến hành pha dung dịch thuốc thử Bradford. Để pha thuốc thử Bradford, đầu tiên cân 0,001 g Coomassie Brilliant Blue, 4,7 g dung dịch ethanol 990 và 8,5 g dung dịch acid phosphoric 85%. Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong dung dịch ethanol 990 trong bình định mức có thể tích là 100ml, thêm vào bình 60 ml nước cất, rồi thêm từ từ acid phosphoric 85% và chỉnh đến 100ml bằng nước cất.
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine plasma-globulin hoặc Bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx độ hấp thụ sẽ tỉ lệ với lượng protein trong mẫu.
Thực hiện một mẫu đối chứng với nước cất (OD0), lấy giá trị ODx: ODx = ODx – OD0
Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo ODx, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành đó chính là lượng protein trong mẫu dung dịch đo.
Xây dựng đường chuẩn (chú ý rửa sạch cuvette bằng cồn, tráng lại bằng nước cất trước và sau khi đổi mẫu đo). Để có dung dịch albumin chuẩn có nồng độ từ 0-50 μg/ml ta thực hiện các bước như bảng 3.1.
Bảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch albumin (mg/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Thuốc thử Coomassie (ml) 2 2 2 2 2 2
Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút, cho 5 ml thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 1. Lắc đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5 ml dịch thuốc thử tuần tự vào các ống từ 2 đến 6 ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Lắc đều, để yên. Tính thời gian ống 1 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595nm (OD595 nm). Tuần tự tiến hành đo OD595 của các ống còn lại ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Lấy OD595 của ống thử thật (có protein) trừ OD595 của ống thử không (không có protein) được OD595. Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang OD595. Đo mẫu thu được, tính hàm lượng protein. Việc đo mẫu cũng tiến hành tương tự với thời gian cho phản ứng là 20 phút. Mẫu được đo pha loãng sao cho giá trị OD595 nằm trong đường chuẩn. Từ lượng protein tính được trong dung dịch đem đo, suy ra tổng lượng protein có trong nguyên liệu ban đầu.
Hàm lượng protein tính theo công thức: b*m*V
w
Với:
b : nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml). m : hệ số pha loãng.
V: tổng số ml dịch chiết thu được.
w: tổng khối lượng canh trường thu được.
(mg/g) HL =
3.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase
Enzyme amylase là enzyme thủy phân tinh bột. Nó phân cắt amylose và amylopectin của tinh bột thành các loại đường maltose, glucose,…Hoạt tính của enzyme amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức hợp tinh bột – iod trước và sau khi thủy phân. Mật độ quang của phức hợp tinh bột – iod sẽ được đo ở bước sóng 595 nm trên máy đo quang phổ.
Hóa chất cần thiết cho thí nghiệm này bao gồm dung dịch Lugol, dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5, dung dịch hồ tinh bột 1%. Dung dịch này được pha bằng cách cân 1 g tinh bột tan cho vào berche đựng 100 ml dung dịch đệm, đun cách thủy cho sôi trong 5 phút, khuấy đều cho tan.
Đối với ống nghiệm chứa enzyme mẫu (An) sẽ được chuẩn bị bàng cách hút 1 ml dung dịch enzyme mẫu cho vào ống nghiệm. Cho thêm 1 ml dung dịch cơ chất (dung dịch hồ tinh bột 1%), cho thêm 1 ml dung dịch đệm pH 5 và 0,5 ml NaCl 3% vào. Cho ống nghiệm vào bể ủ nhiệt 500C, 30 phút. Sau đó cho vào ống nghiệm 1 ml HCl 1N, thêm nước cất vừa đủ 10 ml. Nhỏ 1 giọt dung dịch Lugol, đợi 20 phút rồi đem so màu ở bước sóng 595 nm trên máy quang phổ.
Mẫu chuẩn được pha tương tự mẫu enzyme nhưng thay 1 ml dung dịch enzyme bằng 1 ml dung dịch nước cất.
Mẫu trắng cũng được pha tương tự mẫu enzyme nhưng dùng 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch hồ tinh bột.
Một đơn vị hoạt tính (UI) của amylase là lượng enzyme cần để làm giảm màu tinh bột tan bởi iodine trong 1 phút dưới các điều kiện phản ứng như trên.
Hoạt tính amylase tính theo gam canh trường:
(A0-An)*100*V*n A0*30*w
Nếu tính hoạt lực enzyme amylase trong 1ml dịch enzyme: (A0-An)*100*n
A0*30 Trong đó:
A0 : là mật độ quang của mẫu đối chứng ở bước sóng 595 nm.