Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc thử Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại ở 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Đặc biệt nếu có mặt các acid amin nhân thơm sẽ bắt màu mạnh hơn. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hoá chất bao gồm dung dịch mẫu protein (cụ thể trong bài này là dịch chiết enzyme amylase thu từ các canh trường nuôi cấy), dung dịch albumin 0,1 mg/ml và dung dịch thuốc thử Bradford. Pha dung dịch albumin bằng cách cân chính xác 10 mg albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở nhiệt độ lạnh 200C, khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml. Sau đó tiến hành pha dung dịch thuốc thử Bradford. Để pha thuốc thử Bradford, đầu tiên cân 0,001 g Coomassie Brilliant Blue, 4,7 g dung dịch ethanol 990 và 8,5 g dung dịch acid phosphoric 85%. Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong dung dịch ethanol 990 trong bình định mức có thể tích là 100ml, thêm vào bình 60 ml nước cất, rồi thêm từ từ acid phosphoric 85% và chỉnh đến 100ml bằng nước cất.
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine plasma-globulin hoặc Bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx độ hấp thụ sẽ tỉ lệ với lượng protein trong mẫu.
Thực hiện một mẫu đối chứng với nước cất (OD0), lấy giá trị ODx: ODx = ODx – OD0
Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo ODx, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành đó chính là lượng protein trong mẫu dung dịch đo.
Xây dựng đường chuẩn (chú ý rửa sạch cuvette bằng cồn, tráng lại bằng nước cất trước và sau khi đổi mẫu đo). Để có dung dịch albumin chuẩn có nồng độ từ 0-50 μg/ml ta thực hiện các bước như bảng 3.1.
Bảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch albumin (mg/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Thuốc thử Coomassie (ml) 2 2 2 2 2 2
Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút, cho 5 ml thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 1. Lắc đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5 ml dịch thuốc thử tuần tự vào các ống từ 2 đến 6 ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Lắc đều, để yên. Tính thời gian ống 1 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595nm (OD595 nm). Tuần tự tiến hành đo OD595 của các ống còn lại ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Lấy OD595 của ống thử thật (có protein) trừ OD595 của ống thử không (không có protein) được OD595. Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang OD595. Đo mẫu thu được, tính hàm lượng protein. Việc đo mẫu cũng tiến hành tương tự với thời gian cho phản ứng là 20 phút. Mẫu được đo pha loãng sao cho giá trị OD595 nằm trong đường chuẩn. Từ lượng protein tính được trong dung dịch đem đo, suy ra tổng lượng protein có trong nguyên liệu ban đầu.
Hàm lượng protein tính theo công thức: b*m*V
w
Với:
b : nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml). m : hệ số pha loãng.
V: tổng số ml dịch chiết thu được.
w: tổng khối lượng canh trường thu được.
(mg/g) HL =