Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường đặc (còn gọi là môi trường len men bán rắn), nhưng chủ yếu vẫn là nuôi cấy trên môi trường đặc. Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme thường sử dụng môi trường đặc để nuôi cấy thu nhận enzyme từ vi sinh vật.
Môi trường lên men bán rắn thường dùng nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, cám mì, bã đậu nành, ngô mảnh,… Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất khác nhau và một số thành phần khác cho thích hợp.
Khi nuôi cấy theo phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường, rồi sinh tổng hợp ra enzyme ngoại bào và nội bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng và hoạt tính enzyme cao, chế phẩm dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần sử dụng những thiết bị đặc biệt, tiêu thụ năng lượng ít nên có thể áp dụng ở nhiều địa phương. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tốn diện tích mặt bằng và đòi hỏi lượng nhân công lớn, khó cơ giớ hóa trong sản xuất.
Ưu điểm khác của phương pháp này là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác, thường chỉ xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ nên dễ xử lí. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa.