Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1. Bằng cách thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với mật độ 0,8*108
bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.
Thu nhận enzyme từ canh trường ở các mốc thời gian khác nhau: sau 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ, 40 giờ và sau 44 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.3 Biểu diễn hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ canh trường nuôi
cấy A. niger với các mốc thời gian thu nhận khác nhau.
Khoảng thời gian A. niger tạo enzyme amylase mạnh mẽ là sau 24 – 32 giờ nuôi cấy. Hoạt tính và hàm lượng enzyme cao nhất đạt được sau 28 giờ nuôi cấy. Trong khoảng thời gian từ 8 đến trước 24 giờ nuôi cấy, lượng enzyme tăng rất chậm. Hoạt tính và hàm lượng enzyme tăng mạnh sau 24 đến 28 giờ nuôi cấy. Sau 28 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme giảm nhanh nhưng hàm lượng protein giảm chậm. Sau 36 giờ nuôi cấy, hoạt tính của amylase còn rất thấp. Có thể sau 36 giờ nuôi cấy, A. niger bắt đầu tạo bào tử, nên hàm lượng protein giảm và hoạt tính amylase giảm nhanh.
Khi nuôi vi sinh vật thu enzyme amylase, có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau, đó là quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích lũy enzyme trong môi trường. Và trong thực tế, hai quá trình này không hề khớp với nhau về mặt thời gian.
Theo nhiều ý kiến, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào đạt đỉnh sinh trưởng. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật chỉ tổng hợp nên một lượng amylase ngoại bào rất ít, và chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme amylase cực lớn. Người ta cho rằng sự tổng hợp enzyme amylase bắt đầu khi mà việc tạo protein của tế bào đã kết thúc hoặc gần kết thúc và cạnh tranh với quá trình này.
Thời gian nuôi để tạo lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc tính chất sinh sinh lí của từng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.