men bán rắn
4.2.1. Nấm mốc Mucor
Bào tử Mucor từ ống nghiệm thạch nghiêng được cấy sang đĩa Petri và miếng lame trong phòng ẩm chứa môi trường PGA theo phương pháp đã mô tả ở mục 3.3.3, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2 - 3 ngày.
Hình 4.2 Hình ảnh đại thể của Mucor. (a)hình ảnh đại thể, (b) hình ảnh vi thể.
Hình ảnh đại thể cho thấy Mucor tạo khuẩn lạc hình tròn, mọc nhanh trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng, có dạng nhung, có tơ mịn. Khuẩn lạc còn non có màu trắng đục, khi già chuyển sang màu trắng sữa, có tơ dài.
Hình ảnh vi thể quan sát được cho thấy Mucor có cuống bào tử
phân nhánh và mọc lên ở bất kì chỗ nào của sợi nấm, bào tử đính nằm trong bọc bào tử. Bọc bào tử dạng tròn hoặc hình quả lê, chứa nhiều bào tử ở phía trong.
4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu
Tiến hành pha chế các môi trường có tỷ lệ cơ chất cám gạo: trấu: bã đậu nành khác nhau, làm ẩm với nước có bổ sung dung dịch dinh dưỡng với nồng độ X1 để đạt độ ẩm 55%, chỉnh về pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị.
Sau 36 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.8 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy
Mucor với các tỷ lệ cơ chất khác nhau.
Hàm lượng protein thu được cao nhất ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 1:1:2, nhưng ở môi trường này, hoạt tính amylase thu được lại là thấp nhất.
Điều này cho thấy, với tỷ lệ bã đậu nành trong môi trường cao, nấm Mucor sẽ sinh tổng hợp loại enzyme khác phù hợp với cơ chất cảm ứng là bã đậu nành. Trong môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 2:1:1, hàm lượng protein thu được cũng tương đối cao, và hoạt tính amylase thu được là cao nhất (20,651 mg/g và 250,999 UI/g CT). Điều này chứng tỏ đây là môi trường có tỷ lệ cơ chất thích hợp nhất cho việc cảm ứng Mucor sinh tổng hợp enzyme amylase. Dù bã đậu nành có thể sẽ kích thích Mucor tạo enzyme không mong muốn, nhưng với số lượng ít trong môi trường nó có tác dụng bổ sung thêm nguồn Nitơ cho môi trường nuôi cấy.
Nồng độ carbon và các nguồn carbon khác nhau có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ enzyme amylase khi nuôi nấm mốc. Trong đó, để đảm bảo có hoạt lực α-amylase cao cần có ít nhất 6% tinh bột, còn muốn có hoạt lực oligo-1,6-glucosidase cao chỉ cần 2% tinh bột. Bột đậu nành sẽ ức chế việc tạo thành α-amylase, nhưng lại kích thích mạnh mẽ oligo-1,6-glucosidase.
Tuy cám gạo và bã đậu nành là phế liệu của các ngành công nghiệp, nhưng cả hia đều tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, nguồn dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thể có thể thay một phần cám và bã bằng các cấu tử rẻ tiền hơn, như trấu chẳng hạn. Cấu tử bổ xung này sẽ góp phần làm xốp môi trường. Có thể dùng cặn bã của canh trường rắn sau khi li trích enzyme làm cấu tử chính của canh trường nuôi cấy nhưng phải đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử của các vi sinh vật khác nên cần thanh trùng kĩ để bảo đảm chúng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai.
Tỷ lượng giữa carbon và nitơ cũng có ý nghĩa rất lớn đối với sự sinh tổng hợp enzyme amylase từ vi sinh vật. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được lượng enzyme amylase cực lớn. vì vậy, trong môi trường có tỷ lệ cơ chất là 2 cám: 1 trấu: 1bã đậu nành có được tỷ lệ giữa carbon và nitơ thích hợp nhất, vì vậy, lượng enzyme và hoạt tính amylase thu được ở canh trường này là cao nhất.
4.2.3. Ảnh hưởng của pH
Chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1, khảo sát ảnh hưởng của pH. Thêm nước cất, môi trường dinh dưỡng để môi trường nuôi cấy có nồng độ dinh dưỡng X1, và độ ẩm 55%. Điều chỉnh pH để có môi trường nuôi cấy có pH từ 2 đến 8.
Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.
Sau 36 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.9 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy
Mucor với các pH môi trường khác nhau.
Hoạt tính và hàm lượng thu được từ môi trường pH5 là cao nhất (23,046 mg/g và 263,427 UI/g CT). Ở các môi trường có pH 4 và pH 6, hàm lượng protein và hoạt tính amylase cũng tương đối cao hơn những môi trường còn lại. Vậy có lẽ pH từ 4 đến 6 trong môi trường ban đầu là thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Mucor. Trong môi trường có pH 2, cả giá trị hàm lượng và hoạt tính thu được đều thấp, có thể do Mucor không sinh trưởng được trong môi trường có tính chất acid qua mạnh. Ở môi trường pH 7 và 8, hoạt tính amylase thu được là thấp nhưng hàm lượng protein trong canh trường vẫn tương đối cao do lượng protein có sẵn trong môi trường. Và từ biểu đồ trên ta cũng thấy được sự ảnh hưởng của pH đến sự ion hóa của cơ chất và độ bền bên trong cơ chất.
pH có ảnh hưởng rõ rệt lên sự tăng trưởng của vi sinh vật. Mỗi loài chỉ phát triển trong một khoảng pH xác định. Đa số nấm mốc phát triển trong môi trường hơi acid và chúng là những vi sinh vật ưa acid thuộc nhóm acidophile.
Mặc dù chúng sống trong pH acid yếu, nhưng chúng lại có pH nội bào gần với giá trị trung tính. Đây có thể là kết quả của sự thẩm thấu của các proton qua màng tế bào chất. Có thể là các ion OH- và H+ bị loại ra bên ngoài để duy trì một pH nội bào phù hợp. Thê nhưng pH môi trường trong len men bán rắn lại ít bị thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy do chúng có một hệ đệm tốt.
Nấm mốc tuy có khả năng sinh trưởng trong vùng pH tương đối rộng, tuy nhiên vẫn có mức giới hạn cho sự chịu đựng của chúng. Những thay đổi mạnh về pH của môi trường ngoài cũng có thể làm biế đổi sự ion hóa các phân tử dưỡng chất và phản ứng khử của chúng sẽ làm cho nấm bị thiếu chất dinh dưỡng.
4.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%. Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.
Thu nhận enzyme từ canh trường ở các mốc thời gian khác nhau: sau 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ, 40 giờ và sau 44 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.10 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy
Mucor với các mốc thời gian thu nhận khác nhau.
Thời gian thích hợp nhất để thu amylase từ môi trường nuôi cấy Mucor là 32 giờ sau khi cấy (34,084 mg/g và 414,722 UI/g CT). Khoảng thời gian từ sau 28 giờ cấy, Mucor bắt đầu sinh tổng hợp mạnh mẽ enzyme amylase. Trước đó, lượng amylase thu được không nhiều và hoạt tính cũng không cao. Nhưng từ sau 36 giờ nuôi cấy, hoạt tính amylase giảm nhanh chóng, song hàm lượng protein lại giảm chậm hơn, điều lày có thể do từ sau 36 giờ nuôi cấy, Mucor chuyển sang dạng bào tử nên hàm lượng amylase không còn nhiều trong canh trường, dẫn dến hoạt tính của amylase giảm. Vậy thời gian nuôi cấy có ý nghĩa rất quan trọng trong việc thu nhận amylase từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Theo lý thuyết hiện đại thì giữa vận tốc sinh trưởng riêng của vi sinh vật và tốc độ sinh tổng hợp enzyme có mối tương quan phụ thuộc. Kiểu phụ thuộc thứ nhất là vận tốc sinh trưởng của vi sinh vật hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc sinh tổng hợp enzyme. Kiểu phụ thuộc thứ hai là ngoài sự tổng hợp enzyme trong pha sinh trưởng, còn có sự tổng hợp enzyme thêm. Sự tạo thêm này không liên quan tỷ lệ thuận với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Sự tạo thêm này được thực hiện bởi các tế bào chuyển sang quá trình tự phân và phụ thuộc vào độ bền vững của các ribonucleic acid thông tin. Như vậy là khả năng không trùng khớp của các giai đoạn sinh trưởng với giai đoạn sinh tổng hợp enzyme được xác đinh bằng độ bền của ribonucleic acid thông
tin (ribonucleic acid khuôn). Vì vậy mà qua trình tích lũy enzyme cực đại trong canh trường chỉ xảy ra sau quá trình sinh sản của nấm.
Thời gian nuôi để tạo lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc tính chất sinh sinh lí của từng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì t làm giảm hoạt lực của enzyme.
4.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%. Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 8*108
bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.
Đem nuôi cấy trong các tủ sấy với các nhiệt độ như sau: 300C, 350C, 400C, 450C, 500C và 550C, thu dịch chiết enzyme từ canh trường sau 32 giờ, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.11 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy
Mucor với các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.
Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh tổng hợp amylase là 300C, ở nhiệt độ này hàm lượng và hoạt tính đều cao. Chứng tỏ tỷ lệ hàm lượng amylase trong canh trường khi
chóng ở những môi trường nuôi cấy trên 400C, do nhiệt độ cao ức chế khả năng sinh trưởng của Mucor. Đến 550C, lượng protein còn rất thấp, kéo theo hoạt tính của amylase trong môi trường cũng rất thấp.
Cũng như mọi sinh vật sống, nấm mốc cũng chịu ảnh hưởng sâu sắc của nhiệt độ môi trường. Chúng đặc biệt nhạy cảm do có cấu tạo đơn bào và tính biến nhiệt. Vì thế mà có sự biến thiên rất mạnh của hoạt tính enzyme khi có sự thay đổi của nhiệt độ nuôi cấy. Thân nhiệt của cơ thể nấm phản ánh trực tiếp nhiệt độ của môi trường.
Một trong những nhân tố quan trọng nhất có liên quan đến tác động của nhiệt độ trên sự tăng trưởng, đó là nhiệt cảm ứng của những phản ứng thủy phân được xúc tác bởi enzyme. Ở mức nhiệt độ thấp, sự tăng nhiệt độ sẽ tỉ lệ thuận với sự tăng vận tốc tăng trưởng. Khi đó hoạt động biến dưỡng sẽ được gia tăng và vi sinh vật cũng sẽ phát triển nhanh hơn. Nhưng nếu vượt quá một điểm nào đó (điểm tối ưu), sự tăng trưởng của sinh vật sẽ giảm và nếu tiếp tục tăng nhiệt độ sẽ gây chết vi sinh vật. Nhiệt độ cao sẽ làm các vi sinh vật bị tổn thương do enzyme bị biến tính, đồng thời cũng ảnh hưởng rất lớn đến các hệ thống vận chuyển và các protein khác. Nếu các enzyme chức năng hoạt động với vận tốc nhanh hơn ở nhiệt độ cao vi sinh vật có thể bị tổn thương và sự tăng trưởng sẽ bị ức chế.
Sự tăng trưởng của nấm nói riêng và của vi sinh vật nói chung phụ thuộc đặc biệt vào nhiệt độ. Có ba mức của nhiệt sinh trưởng, gồm nhiệt độ tối thiểu, nhiệt độ tối đa và nhiệt độ tối thích. Và dù đường cong tăng trưởng theo nhiệt độ có thể biến đổi, nhưng nhiệt độ tối thích bao giờ cũng gần với nhiệt độ tối đa hơn là nhiệt độ tối thiểu. Tuy nhiên, nhiệt độ sinh trưởng cũng còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác của môi trường nuôi cấy như pH, chất dinh dưỡng có sẵn.
4.2.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu
Độ ẩm vừa ảnh hưởng đến sinh trưởng vừa ảnh hưởng đến trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 để khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm. Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và pH 5 để điều chỉnh độ ẩm các môi trường đến 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.
Sau 32h nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.
Đồ thị 4.12 Biểu diễn hoạt tính amylse và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy
Mucor với các độ ẩm môi trường ban đầu khác nhau.
Hoạt tính amylase và hàm lượng protein cao nhất thu được từ môi trường có độ ẩm ban đầu là 55%. Sau đó độ ẩm giảm mạnh có thể do môi trường quá ẩm nên ngăn cản sự khuếch tán O2 vào môi trường. Còn trước đó, hàm lượng và hoạt tính lại có xu hướng tăng dần vì khi tăng độ ẩm trong phạm vi thích hợp kéo theo tốc độ sinh trưởng và tiêu thụ O2 tăng theo, nhờ đó, amylase cũng được sinh ra nhiều hơn.
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường lên men bán rắn cho nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase là 55 – 60% và phải giữ cho việc ổn định của độ ẩm trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50% sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Còn nếu nuôi trong điều kiện môi trường không được vô trùng tuyệt đối cần lưu ý độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật khác.
4.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng
Do nhiều chất dinh dưỡng có thể ở dưới mức tối ưu thậm chí không có trong cơ chất đang sử dụng, nên cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng từ bên ngoài khi pha chế môi trường lên men. Trong phần này chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ
lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%, pH 5 và các nồng độ dinh dưỡng X1, X2 , X3, X4, X5, X6,