Enzyme amylase là enzyme thủy phân tinh bột. Nó phân cắt amylose và amylopectin của tinh bột thành các loại đường maltose, glucose,…Hoạt tính của enzyme amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức hợp tinh bột – iod trước và sau khi thủy phân. Mật độ quang của phức hợp tinh bột – iod sẽ được đo ở bước sóng 595 nm trên máy đo quang phổ.
Hóa chất cần thiết cho thí nghiệm này bao gồm dung dịch Lugol, dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5, dung dịch hồ tinh bột 1%. Dung dịch này được pha bằng cách cân 1 g tinh bột tan cho vào berche đựng 100 ml dung dịch đệm, đun cách thủy cho sôi trong 5 phút, khuấy đều cho tan.
Đối với ống nghiệm chứa enzyme mẫu (An) sẽ được chuẩn bị bàng cách hút 1 ml dung dịch enzyme mẫu cho vào ống nghiệm. Cho thêm 1 ml dung dịch cơ chất (dung dịch hồ tinh bột 1%), cho thêm 1 ml dung dịch đệm pH 5 và 0,5 ml NaCl 3% vào. Cho ống nghiệm vào bể ủ nhiệt 500C, 30 phút. Sau đó cho vào ống nghiệm 1 ml HCl 1N, thêm nước cất vừa đủ 10 ml. Nhỏ 1 giọt dung dịch Lugol, đợi 20 phút rồi đem so màu ở bước sóng 595 nm trên máy quang phổ.
Mẫu chuẩn được pha tương tự mẫu enzyme nhưng thay 1 ml dung dịch enzyme bằng 1 ml dung dịch nước cất.
Mẫu trắng cũng được pha tương tự mẫu enzyme nhưng dùng 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch hồ tinh bột.
Một đơn vị hoạt tính (UI) của amylase là lượng enzyme cần để làm giảm màu tinh bột tan bởi iodine trong 1 phút dưới các điều kiện phản ứng như trên.
Hoạt tính amylase tính theo gam canh trường:
(A0-An)*100*V*n A0*30*w
Nếu tính hoạt lực enzyme amylase trong 1ml dịch enzyme: (A0-An)*100*n
A0*30 Trong đó:
A0 : là mật độ quang của mẫu đối chứng ở bước sóng 595 nm. An : là mật độ quang của mẫu enzyme ở bước sóng 595 nm. n : hệ số pha loãng
HT =
HT = (UI/ml)
V : thể tích dịch chiết enzyme thu được sau khi lọc (ml). w : khối lượng canh trường ban đầu đem ly trích (g).
Hoạt tính riêng tính theo công thức:
HT chung HL protein