chủng DH5α. Các khuẩn lạc xanh mang plasmid pBT, các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp.
3.1.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR
Hình 3.4: Ảnh kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
M: Marker 1Kb; Hàng 1: Plasmid chứa đoạn A; Hàng 2: Plasmid chứa đoạn V1; 1,2,3,4,5,6,7 : BG; 8,9,10,11,12,13,14: HN; 15,16,17,18,19,20,21: LS
Chọn một số khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-F1và pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn DNA mong muốn. Ở đây không chạy colony-PCR với cặp mồi đặchiệu: vì khi gắn đoạn gen vào vector pBT, cóthể còn một lƣợng lớn đoạn DNA không đƣợc gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng. Nên khi cấy trải dịch hỗn hợp lên đĩa thạch vẫn còn một lƣợngsản phẩm PCR nhất định xung quanh khuẩn lạc, vì vậy dễ chọn nhầm khuẩn lạcdƣơng tính.Sản phẩm colony-PCR từ những dòng mang plasmid có gắn gen CP có kích thƣớc khoảng 700 bp; còn những dòng plasmid có gắn đoạn gen A có kích thƣớc khoảng 2500 bp. Kết quả colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.4)
Phƣơng pháp colony-PCR có tác dụng loại trừ phần lớn các khuẩn lạc (trắng) mang plasmid không mong muốn. Dựa vào kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng khuẩn lạc trắng, chúng tôi lựa chọn mỗi mẫu 2 khuẩn lạc để nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung Carbenicillin 50 mg/l và tiến hành tách chiết plasmid để phục vụ cho việc xác định trình tự.
3.1.5. Tách plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra sự có mặt của gen tách dòng
Hình 3.5: Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự
1-3: Plasmid chứa đoạn A; 4-6: Plasmid chứa đoạn V1; 1, 4: BG; 2, 5: HN; 3, 6: LS Sau khi chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các giếng sản phẩm colony- PCRcó kích thƣớc phù hợp theo lý thuyết và nuôi trong 5 ml LB lỏng trong 16 giờ,chúng tôi tiến hành tách plasmid theo quy trình nhƣ đã trình bầy ở mục 2.2.8.
Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.65) cho thấy đảm bảo số lƣợng và chất lƣợng phục vụ cho đọc trình tự.
Mặc dù vậy, trong quá trình gắn sản phẩm PCR vào vector, có thể có một số sản phẩm phụ cũng đƣợc gắn vào vector. Tức là, có những đoạn có kích thƣớc lớn hơn hoặc nhỏ hơn đoạn gen quan tâm. Do đó, cần phải kiểm tra sản phẩm plasmid đã chọn bằng phƣơng pháp cắt enzyme giới hạn. Dựa vào bản đồ vector pBT có 2 điểm cắt của BamHI nằm trong vùng cắt đa vị trí. Do đó, chúng tôi sử dụng
enzyme BamHI để cắt plasmid tái tổ hợp thành vector và đoạn DNA ngoại lai riêng rẽ. Sau khi cắt, sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di đƣợc trình bày ở hình 3.76.
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng BamHI. M: Marker 1 Kb; Giếng số 1-2: Plasmid mang gen V1; Giếng số 3-4: Plasmid mang gen A. M: Marker 1 Kb; Giếng số 1-2: Plasmid mang gen V1; Giếng số 3-4: Plasmid mang gen A.
Ảnh điện di sản phẩm cắt trên hình 3.7 6 cho thấy, tại các giếng số 1, 2, 3, 4 các plasmid tái tổ hợp đƣợc tách từ khuẩn lạc trắng sau khi đƣợc cắt bằng enzyme BamHI đều xuất hiện 2 băng khác nhau: Một băng ở phía trên có kích thƣớc khoảng 2,7 kb phù hợp với kích thƣớc của vector pBT và một băng ở phía dƣới có kích thƣớc khoảng 500 bp và 2300 bp phù hợp với kích thƣớc đoạn gen quan tâm. Nhƣ vậy, có thể khẳng định là việc nối ghép sản phẩm tách dòng với vector tách dòng pBT đã đạt đƣợc kết quả mong muốn.
M 1 2 3 4 ~2,7 Kb ~2,3 Kb ~0,5 Kb 1 Kb 3 Kb 2.5 Kb Comment [SCD22]: BamHI
Để khẳng định chắc chắn các dòng gen thu đƣợc là gen V1 và A, chúng tôi tiến hành tinh sạch các dòng plasmid tái tổ hợp và giải trình tự gen.
3.1.6. Kết quả xác định trình tự nucleotide
Các thể phân lập sau khi đƣợc đọc trình tự trên máy đọc tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer đƣợc xử lý bằng các phần mềm máy tính chuyên dụng BioEdit, DNAstar, Chromas. Những trình tự này đƣợc so sánh trong BLAST của NCBI cho thấy đề tài đã phân lập thành công vòng DNA-A của 3 thể phân lập BG, HN và LS. Các thể phân lập nghiên cứu đều thuộc chi Begomovirus.
Kết quả xác định trình tự cho thấy, các DNA-A của ba thể phân lập nghiên cứu có kích thƣớc sai khác nhau một vài nucleotide (Bảng 3.1). Tuy nhiên, sự sai khác này tập trung ở vùng liên gen (IR), vì vậy sẽ không ảnh hƣởng đến kích thƣớc trình tự của các gen trên DNA-A (Hình 3.7).
Bảng 3.1. Kích thƣớc và vị trí các gen trên vòng DNA-A (Đơn vị: nucleotide)
Mẫu DNA-A Pre-CP CP C3 C2 C1 C4
HN 2738 127- 487 287- 1057 1057- 1461 1202- 1606 1509- 2593 2144- 2436 BG 2747 131- 481 291- 1064 1061- 1465 1206- 1611 1514- 2598 2149- 2441 LS 2756 134- 484 294- 1067 1064- 1468 1209- 1616 1516- 2603 2154- 2446
Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự nucleotide vòng DNA-A giữa 3 thể phân lập HN,
BG, LS.
Dấu chấm (.) biểu thị sự giống nhau, sai khác biểu thị bằng các chữ cái in hoa (IR)
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
3.2.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide
- So sánh trình tự DNA-A của các thể phân lập nghiên cứu với nhau:
Sau khi so sánh trình tự nucleotide vòng DNA-A giữa 3 thể phân lập HN, BG, LS cho kết quả hệ số tƣơng đồng dao động từ 87% - 92,2% (Bảng 3.2). Trong đó độ tƣơng đồng giữa hai thể phân lập HN và LS khá cao 92,2%. Tiếp đến 88,8% và 87% là độ tƣơng đồng giữa thể phân lập BG so với thể phân lập HN, LS. Theo tiêu chuẩn của Ủy ban Quốc tế về phân loại virus (International committee on Taxonomy of Viruse, ICTV) đối với chi Begomovirus thì hai dòng virus có độ tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide DNA-A trên 89% thì có thể coi là cùng một loài [10]. Nhƣ vậy có thể kết luận: thể phân lập HN và LS có thể là cùng một loài, thể phân lập BG là một loài khác.
- So sánh trình tự DNA-A của các thể phân lập nghiên cứu với các trình tự trên
GenBank:
Hình 3.9: Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG
Bảng 3.2: Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotide vòng DNA-A của 3 thể phân lập HN, BG, LS với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới
Hệ số tƣơng đồng
Hệ
số
sai k
Dựa vào kết quả BLAST/NCBI (Hình 3.8, 3.9, 3.10) và bảng hệ số tƣơng đồng (Bảng 3.2) cho thấy:
+ Độ tƣơng đồng của thể phân lập BG so với các mẫu trên thế giới dao động từ 61,8% đến 92,5%. Trong đó độ tƣơng đồng so với nhóm Old world dao động từ 61,8% đến 67,2%, còn so với nhóm New world từ 71,3% đến 92,5%.
+ Độ tƣơng đồng của thể phân lập HN so với các mẫu trên thế giới dao động từ 62,1% đến 97,4%. Trong đó độ tƣơng đồng so với nhóm Old world dao động từ 62,1% đến 67,3%, còn so với nhóm New world từ 71,8% đến 97,4%.
+ Độ tƣơng đồng của thể phân lập LS so với các mẫu trên thế giới dao động từ 62,3% đến 98,4%. Trong đó độ tƣơng đồng so với nhóm Old world dao động từ 62,3% đến 64%, còn so với nhóm New world từ 71,4% đến 98,4%.
Theo tiêu chuẩn của Ủy ban Quốc tế về phân loại virus (International committee on Taxonomy of Viruse, ICTV) đối với chi Begomovirus thì hai dòng virus có độ tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide DNA-A trên 89% thì có thể coi là cùng một loài [10]. Dựa vào tiêu chuẩn này có thể kết luận thể phân lập HN cùng loài với Tomato leaf curl Hanoi virus (có độ tƣơng đồng 97,4%).
Thể phân lập BG thuộc loài Tomato leaf curl Hainan virus (độ tƣơng đồng là
92,5%). Tƣơng tự, thể phân lập LS cùng loài với Papaya leaf curl China virus (độ tƣơng đồng là 98,4%).
3.2.2. Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua cây phát sinh chủng loại cây phát sinh chủng loại
Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Maximum Parsimony (MP) sử dụng ClustalW/DNAstar để so sánh các trình tự gen virus của ba tỉnh phân lập đƣợc với 47 trình tự gen của các loài Begomovirus khác nhau trên thế giới đƣợc công bố trên Ngân hàng gen (NCBI).
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) dựa trên
việc so sánh trình tự gen của 3 thể phân lập HN, BG, LS với 47 trình tự gen của các loài Begomovirus khác trên thế giới.
*Chú thích: ToLCVnV-Tomato leaf curl Vietnam virus, ToLCHnV-Tomato leaf curl Hainan virus, ToLCHNV- Tomato leaf curl Hanoi virus, PaLCCNV-Papaya leaf curl China virus, KuMV-Kuzud mosaic virus. Virus OW và NW- tƣơng ứng là những loài virus thuộc nhóm virus Old Word và New Wor
Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0 44.0 5 10 15 20 25 30 35 40 GQ870288 - ToLCVnV FN434083 - ToLCHnV HQ162268 - ToLCHnV 100.0 99.9 BG 71.8 HN HQ162270 - ToLCHNV 100.0 42.9 DQ641700 - PaLCCNV JF682837 - PaLCCNV 98.7 LS 100.0 AJ558116 99.9 AJ558117 JX555979 100.0 AJ704604 99.7 99.2 AJ876548 99.4 66.3 AJ851005 66.3 AF414287 DQ641698 100.0 EU368372 45.2 GU723708 55.9 86.9 DQ641695 85.6 AJ810096 DQ641696 100.0 AJ810157 59.3 NA AJ849916 X74516 100.0 JN809812 99.6 AF195782 AF327436 100.0 37.8 36.1 AJ438936 DQ641701 100.0 DQ641699 51.5 46.3 AY514630 GU723734 99.9 AJ420319 100.0 AY234383 99.1 AJ566744 81.6 32.4 AJ002459 AJ314739 97.2 AM050730 67.7 77.9 AB116629 S53251 62.2 78.2 M88179 X99550 94.8 X15983 90.6 AF012300 100.0 AF132852 78.3 AF239671 100.0 100.0 DQ641690 - KuMV Virus O W Vi rus N W
Qua hình 3.11 thấy rằng cây phát sinh chủng loại chia làm 2 nhánh chính: nhánh thứ nhất là loài Kuzud mosaic virus có quan hệ họ hàng xa nhất với các
loài còn lại. Nhánh thứ hai gồm các trình tự gen của các loài Begomovirus còn
lại, trong nhánh chia làm hai nhánh nhỏ là OW và NW viruses. Và ba thể phân lập ở Việt Nam đều nằm cùng nhánh với các loài virus thuộc nhóm virus OW, chứng tỏ chúng thuộc nhóm virus OW. Trong đó, thể phân lập LS có quan hệ gần gũi nhất với các thể phân lập/dòng Papaya leaf curl China virus với độ
tƣơng đồng di truyền khá cao trên 98%, cao nhất là 98,4% khi so sánh với thể phân lập Papaya leaf curl China virus mã số DQ641700 phân lập trên cây thuốc lá thu thập tại Hà Nội (Hà Tây cũ) ở Việt Nam. Trong khi đó, cũng tại địa điểm này, trên cây thuốc lá, chúng tôi lại phân lập đƣợc virus (thể phân lập HN) có quan hệ gần gũi nhất với thể phân lập/dòng Tomato leaf curl Hanoi virus (mã số HQ162270) với hệ số tƣơng đồng di truyền cũng khá cao (97,4%). Còn thể phân lập BG có quan hệ gần gũi nhất với thể phân lập/dòng Tomato leaf curl Hainan
virus có mã số FN434083 phân lập ở Trung Quốc với hệ số tƣơng đồng di
truyền 92,5%.
Nhƣ vậy, kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng tƣơng thích với kết quả so sánh độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide. Độ tƣơng đồng của các thể phân lập Việt Nam nghiên cứu so với các loài Begomovirus gần nhất trên thế
giới đều trên 92%. Theo tiêu chuẩn của Ủy ban Quốc tế về phân loại virus (International committee on Taxonomy of Viruse, ICTV) đối với chi
Begomovirus thì hai dòng virus có độ tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide trên 90% thì có thể coi là cùng một loài [10]. Vì vậy, không có loài virus mới nào đƣợc tìm thấy trong 3 mẫu nghiên cứu.
Begomovirus là chi có sự đa dạng về trình tự genome DNA-A rất lớn (dao
động từ 60-100%). Sự đa dạng này giúp cho virus có thể thích nghi trong những điều kiện môi trƣờng sống khác nhau. Ba thể phân lập nghiên cứu thuộc ba loài virus Papaya leaf curl China virus, Tomato leaf curl Hainan virus và Tomato leaf curl Hanoi virus trong chi Begomovirus. Điều này chứng tỏ, mỗi cây trồng
có thể nhiễm một hay nhiều loại virus và ngƣợc lại mỗi virus có thể gây bệnh trên nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau. Kết quả nghiên cứu này cũng đóng góp thêm vào dữ liệu trình tự gen vòng DNA-A ở Việt Nam cũng nhƣ thế giới.
Tuy nhiên, để có thể tạo ra cây chuyển gen có phổ kháng rộng với các loại TLCV thì cần tiến hành các nghiên cứu một cách toàn diện hơn về tính đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh xoăn lá thuốc lá trên nhiều vùng khác nhau của Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1) Nhân dòng và xác định trình tự thành công toàn bộ vòng DNA-A của các dòng virus gây bệnh xoăn lá trên cây thuốc lá thu thập ở 3 tỉnh miền Bắc Việt Nam bao gồm Bắc Giang-BG (2747 nucleotide), Lạng Sơn-LS (2756 nucleotide), Hà Nội (Ba Vì)-HN (2738 nucleotide).
2) Độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của ba thể phân lập HN, BG, LS so với nhau dao động từ 87% đến 92,2%, còn so với các trình tự công bố trên GenBank dao động từ 61,8% đến 98,4%.
3) Ba thể phân lập nghiên cứu thuộc nhóm OW và là ba loài khác nhau trong chi Begomovirus: BG - Tomato leaf curl Hainan virus, HN - Tomato leaf curl Hanoi virus, LS - Papaya leaf curl China virus.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục thu thập và tách dòng gen các dòng virus TLCV ở các địa phƣơng khác để có một đánh giá tổng thể về các virus gây bệnh xoăn lá trên cây thuốc lá ở Việt Nam và tạo cơ sở cho việc xây dựng chiến lƣợc tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh xoăn lá.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Chu Hoàng Hà (2010)Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virusgây ra bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi). Báo cáo tổng kết đề tài.
2. Nguyền Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2008) Phân lập gen mã hóa Protein vỏ của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua thu thập trên cây cà chua dại tại tỉnh Thái Nguyên. Tạp chí Công nghệ
Sinh học6(4): 467-474.
Tài liệu tiếng Anh
1. Abhary MK, Anfoka GH, Nakhala MK, Maxwell DP (2006) Post- transcriptional gene silencing in controlling viruses of the Tomato yellow leaf curl virus complex. Arch Virol 151: 2349-2363.
2. Antignus Y, Lapidot M, Ganaim N, Cohen J, Lachman O, Pearlsman A, Raccah B and Gera A (1997) Biological and molecular characterization of tomato spotted wilt virus in Israel. Phytoparasitica 25: 319-330
3. Arguello-Astorga GR & Ruiz-Medrano R (2001) An iteron-related domain is associated to motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acid-base pairs by a comparative approach. Arch
Virol 146: 1465-1485.
4. Bagewadi B, Chen S, Lal SK, Choudhury NR & Mukherjee SK (2004) PCNA interacts with Indian mung bean yellow mosaic virus Rep DNA downregulates Rep activity. J Virol 78(21): 11890-11903.
5. Baulcombe DC (1996) Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in trangenic plants. Plant Cell 8: 1833-1844.
6. Bbyrne DN, DNA Bellows TS (1991) Whitefly biology. Ann Rev Entomol 36: 431-457.
7. Boonham N, Walsh K, Hims M, Preston S, North J and Barker I (2002) Biological and sequence comparisons of Potato virus Y isolates associated with potato tuber necrotic ringspot disease. Plant Pathol 51:117-126.
8. Briddon RW, Bull SE, Amin I, Mansoor S, Bedford ID, Rish N, Siwatch SS, Zafar Y, Abdel-Salam AM, Markham PG (2004) Diversity of DNA1: a satellite- like molecule associated with monopartite-DNAβ complexes. Virology 324: 462-474.
9. Brigneti GO, Voinnet WX, Li LH, Ji SW, Ding and Baulcombe DC (1998) Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in
Nicotiana benthaniana. EMBL J 17: 6739-6746.
10. Fauquet CM, Bridon RW, Brown JK, Moriones E, Stanley J, M Zerbini M, Zhou X (2008) Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Arch Virol 153: 783-821.