Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 50 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml LB lỏng có bổ sung Carbenicillin 50 mg/l để tách plasmid.
2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid
Quy trình
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2 ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 200 µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 400 µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lƣợng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
-Thêm 300 µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nƣớc), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ 40C ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô DNA bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm vào 50 µl nƣớc khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan đến khi hoàn toàn. Plasmid có thể đƣợc bảo quản ở -200 C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI.
Quy trình