STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 3 2 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 5 3 Vector pBT 1 4 T4 buffer 10X 1 5 T4 DNA ligase 1 Tổng thể tích 10 Quy trình
Sản phẩm thôi gel khi đƣợc gắn vào vector tách dòng dƣới sự xúc tác của T4 ligase và năng lƣợng ATP trong dung dịch đệm DNA đƣợc gắn vào vector pBT. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotide Adenin nhô ra ở đầu 3’ của sản phẩm PCR và nucleotide Thymine nhô ra ở đầu 5’ của vector. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 2 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt phƣơng pháp sốc nhiệt
Quy trình
*Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
C.
- Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ
- Đo OD 600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15phút ở trong đá (hoặc ở 40
C).
- Ly tâm 4000 v/p ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút).
- Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100 ml LB ban đầu. - Bổ sung 15- 20% glycerol.
- Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840
C.
*Biến nạp: Sau khi đã gắn DNA vào vector pBT, tiến hành biến nạp sản phẩm gắn vào tế bào khả biến E.coli DH5α đã đƣợc chuẩn bị ở trên, gồm các bƣớc sau:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy ra khỏi tủ -840C, để ngay vào đá trong thời gian từ 10-15 phút.
- Bổ sung toàn bộ sản phẩm gắn vào các ống đựng tế bào khả biến, đảo nhẹ, để trong đá khoảng 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây. - Để tế bào trong đá 5 phút
- Bổ sung 200 µl LB lỏng vào mỗi ống tế bào khả biến. Để lại trong đá 5 phút.
- Sau đó nuôi lắc 220 v/p ở 370C trong thời gian 90 phút.
- Cấy trải 150-250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa carbenicillin 50 mg/l, IPTG 100 mM, X-Gal 0,04% rồi ủ 370C qua đêm.
2.2.7. Phản ứng colony-PCR
Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.