Quy trình
Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X đƣợc đun sôi, để nguội khoảng 50- 60oC, đổ dung dịch vào khay gel. Khi gel đông đặt khay gel vào bể điện di. Tra mẫu DNA trộn với đệm (tỉ lệ 5V mẫu:1V đệm) vào các giếng trên bản gel. Chạy với điện thế từ 80-120V. Quan sát các dải DNA bằng cách nhuộm gel vào dung
dịch EtBr 100 μl/l khoảng 10-15 phút. Sau đó rửa bản gel bằng nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại 300 nm.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quy trình
- Điện di sản phẩm PCR của gen quan tâm trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer theo tỷ lệ : Vmẫu:VBinding buffer = 1:1 ( 1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ 550
C trong 10-15 phút, đảo nhẹ cho đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp sang cột Qiaquick spin, ly tâm hỗn hợp 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, bổ sung 500 µl Wash buffer (hoặc ethanol 700), ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, tiếp tục ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. - Bổ sung 30 µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa màng lọc. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu DNA.
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT
Hình 2.2: Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hoàng et al, 2005)
pBT 2705bp
Bảng 2.7:. Thành phần phản ứng ghép nối STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 3 2 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 5 3 Vector pBT 1 4 T4 buffer 10X 1 5 T4 DNA ligase 1 Tổng thể tích 10 Quy trình
Sản phẩm thôi gel khi đƣợc gắn vào vector tách dòng dƣới sự xúc tác của T4 ligase và năng lƣợng ATP trong dung dịch đệm DNA đƣợc gắn vào vector pBT. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotide Adenin nhô ra ở đầu 3’ của sản phẩm PCR và nucleotide Thymine nhô ra ở đầu 5’ của vector. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 2 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt phƣơng pháp sốc nhiệt
Quy trình
*Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
C.
- Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ
- Đo OD 600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15phút ở trong đá (hoặc ở 40
C).
- Ly tâm 4000 v/p ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút).
- Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100 ml LB ban đầu. - Bổ sung 15- 20% glycerol.
- Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840
C.
*Biến nạp: Sau khi đã gắn DNA vào vector pBT, tiến hành biến nạp sản phẩm gắn vào tế bào khả biến E.coli DH5α đã đƣợc chuẩn bị ở trên, gồm các bƣớc sau:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy ra khỏi tủ -840C, để ngay vào đá trong thời gian từ 10-15 phút.
- Bổ sung toàn bộ sản phẩm gắn vào các ống đựng tế bào khả biến, đảo nhẹ, để trong đá khoảng 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây. - Để tế bào trong đá 5 phút
- Bổ sung 200 µl LB lỏng vào mỗi ống tế bào khả biến. Để lại trong đá 5 phút.
- Sau đó nuôi lắc 220 v/p ở 370C trong thời gian 90 phút.
- Cấy trải 150-250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa carbenicillin 50 mg/l, IPTG 100 mM, X-Gal 0,04% rồi ủ 370C qua đêm.
2.2.7. Phản ứng colony-PCR
Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng colony-PCR STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 8 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 pUC18-F1 (10pmol/µl) 1 6 pUC18-R1 (10pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3
Tổng 20
Bảng 2.9: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 50 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml LB lỏng có bổ sung Carbenicillin 50 mg/l để tách plasmid.
2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid
Quy trình
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2 ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 200 µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 400 µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lƣợng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
-Thêm 300 µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nƣớc), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ 40C ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô DNA bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm vào 50 µl nƣớc khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan đến khi hoàn toàn. Plasmid có thể đƣợc bảo quản ở -200 C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI.
Quy trình
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 6,5 2 Buffer BamHI 1 3 Enzyme BamHI 0,5 4 Template 2 Tổng thể tích 10
- Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm cắt. - Tinh sạch plasmid và đem giải trình tự.
Comment [SCD14]: Isoamyl alcohol
2.2.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tựtƣơng ứng trên GenBank tƣơng ứng trên GenBank
Xác định trình tự nucleotide:
Chọn các mẫu plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu đƣợc qua so sánh các trình tự gen.
Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu được:
So sánh các trình tự thu đƣợc với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác nhận gen tách dòng đƣợc là đoạn gen quan tâm. Sau đó so sánh các trình tự gen ở các tỉnh thành khác nhau với nhau để đánh giá mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các thể phân lập và so sánh với các trình tự tƣơng ứng đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank).
Bảng 2.11: Bảng các mã số (GenBank ID), nguồn gốc các trình tự DNA-A của các chủng virus trên thế giới đƣợc sử dụng trong so sánh tạo cây phát sinh chủng loại
NEW WORLD VIRUSES
STT Loài Vật chủ Mã số
GenBank
Nguồn gốc đất nƣớc
1 Bean dwarf mosaic virus Bean M88179 Braxin 2 Sida golden mosaic Costa Rica virus Sida rhombifolia X99550 Costa Rica 3 Abutilon mosaic virus Abutilon sellovianum
Regel
X15983 Đức 4 Rhynchosia golden mosaic virus Rhynchosia minima AF239671 Honduras 5 Tomato mottle Taino virus Tomato AF012300 Mexico 6 Tomato golden mottle virus Tomato AF132852 Mỹ 7 Kudzu mosaic virus Kudzu DQ641690 Việt Nam
OLD WORLD VIRUSES
STT Loài Vật chủ Mã số
GenBank
Nguồn gốc đất nƣớc
1 Ageratum leaf curl virus Ageratum conyzoides AJ851005 Trung Quốc 2 Ageratum yellow vein virus Weed X74516 Singapore 3 Ageratum yellow vein virus Sauropus androgynus JN809812 Thái Lan 4 Ageratum yellow vein China virus Ageratum conyzoides AJ849916 Trung Quốc 4 Cotton leaf curl Multan virus Cotton AJ002459 Pakistan 5 Erectites yellow mosaic virus Fireweed DQ641698 Việt Nam 6 Eupatorium yellow vein virus Eupatorium makinoi AJ438936 Anh
7 Indian cassava mosaic virus Cassava AJ314739 Ấn Độ 8 Lindernia anagallis yellow vein
virus
False pimpernel DQ641701 Việt Nam 9 Ludwigia yellow vein Vietnam virus Primrose willow DQ641699 Việt Nam 10 Mimosa yellow leaf curl virus Mimosa DQ641695 Việt Nam 11 Papaya leaf curl China virus Corchoropsis timentosa AJ876548 Trung Quốc 12 Papaya leaf curl China virus Siegesbeckia orientalis JF682837 Trung Quốc 14 Papaya leaf curl China virus Tomato AJ558116 Trung Quốc 15 Papaya leaf curl China virus Tobacco DQ641700 Việt Nam 16 Papaya leaf curl China virus Tomato JX555979 Trung Quốc 17 Papaya leaf curl China virus Tomato AJ704604 Trung Quốc 18 Papaya leaf curl China virus Lycopersicon esculentum AJ558117 Trung Quốc 19 Pepper leaf curl virus Chilli AF414287 Malaysia 20 Sida leaf curl virus Sida cordifolia AM050730 Trung Quốc 21 Sida yellow mosaic virus Sida acuta AJ810096 Trung Quốc 22 Sida yellow vein Vietnam virus Arrow leaf DQ641696 Việt Nam 23 Squash leaf curl Yunnan virus Squash AJ420319 Trung Quốc 24 Stachytarpheta leaf curl virus Stachytarpheta AJ810157 Trung Quốc 25 Tobacco leaf curl Yunnan virus Tomato AJ566744 Trung Quốc 26 Tomato leaf curl Gujarat virus Tomato AY234383 NePan 27 Tomato leaf curl Hainan virus Tomato FN434083 Trung Quốc 28 Tomato leaf curl Hainan virus Papaya HQ162268 Việt Nam 29 Tomato leaf curl Hainan virus Papaya HQ162268 Việt Nam 30 Tomato leaf curl Hanoi virus Tomato HQ162270 Việt Nam 31 Tomato leaf curl Laos virus Tomato AF195782 Lào 32 Tomato leaf curl Malaysia virus Tomato AF327436 Malaisia 33 Tomato leaf curl Taiwan virus Tomato GU723708 Đài Loan 34 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ373254 Việt Nam 35 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato EU368372 Việt Nam 36 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ338766 Việt Nam 37 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ870288 Việt Nam 38 Tomato leaf curl virus Tomato S53251 Mỹ 39 Tomato yellow leaf curl Thailand
virus
Tomato AY514630 Thái Lan 40 Tomato yellow leaf curl virus Tomato AB116629 Nhật Bản
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Genome của Tobacco leaf curl virus (TLCV) gồm 2 sợi DNA vòng đơn có chiều dài xấp xỉ 2700 nucleotide. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch DNA của TLCV. Để tách chiết DNA của TLCV chúng tôi sử dụng phƣơng pháp của Accotto và cộng sự (2000), với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Lá thuốc lá nhiễm bệnh đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng để giữ hoạt tính của DNA. Các hóa chất cần thiết (Extraction buffer) đƣợc bổ sung ngay có tác dụng phá vỡ thành tế bào và màng nhân giúp giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) có tác dụng biến tính và tủa protein. DNA tổng số đƣợc thu bằng cách tủa nhờ Isopropanol và rửa bằng cồn 700. Độ tinh sạch của DNA đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ lá bị bệnh xoăn lá ở ba
tỉnh Bắc Giang, Hà Nội và Lạng Sơn. Đƣờng chạy số 1,2,3 - Bắc Giang, Đƣờng chạy số 4,5,6 - Hà Nội, Đƣờng chạy số 7,8,9 - Lạng Sơn
Qua kết quả điện di (hình 3.1) chúng tôi thấy, DNA tổng số tách đƣợc tƣơng đối sạch, không bị đứt gẫy đáp ứng yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Comment [SCD16]: isoamyl alcohol
3.1.2. Kết quả nhân gen bằng phản ứng PCR
Để tăng hiệu quả của phản ứng PCR trong quá trình thực hiện các phản ứng chúng tôi tiến hành điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, lƣợng Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng đƣợc tối ƣu hoá, để đảm bảo cho cho phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu và đạt hiệu quả cao nhất .
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân vòng DNA-A của TLCV
M: Marker 1Kb; 1, 5: HN; 2, 6: BG; 3, 7: LS; 4, 8: đối chứng âm. 1-4: Nhân đoạn gen V1 bằng cặp mồi prV324N/prC889N, 5-8: Nhân đoạn A bằng cặp mồi TYLC- A-F/TYLC-A-R
Sử dụng cặp mồi prV324N/prC889N chúng tôi đã nhân đƣợc đoạn gen V1 của TLCV. Đoạn DNA-A còn lại đƣợc nhân lên bằng cặp mồi TYLCV-A- F/TYLCV-A-R. Kết quả cả 3 mẫu HN, BG và LS đều cho băng đặc hiệu. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR với cặp mồi prV324N/prC889N có kích thƣớc khoảng 500 bp, với cặp mồi TYLCV-A-F/TYLCV-A-R có kích thƣớc khoảng 2300 bp. Kết quả PCR khuếch đại các đoạn DNA vòng DNA-A của TLCV đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2).
Kết quả điện di trên hình cho thấy sản phẩm PCR khá đặc hiệu, cho những băng có kích thƣớc nhƣ tính toán lý thuyết. Chỉ duy nhất mẫu TLCV-HN chạy với cặp mồi prV324N/prC889N xuất hiện 2 băng DNA, trong đó có 1 băng DNA có kích thƣớc mong muốn. Bƣớc đầu kết luận đã nhân dòng thành công các đoạn của DNA-A của TLCV. Để có kết luận chính xác hơn chúng tôi tiến hành tách dòng và đọc trình tự gen.
Comment [SCD18]: Marker
3.1.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pBT. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành liên kết photphodieste giữa đầu A sản phẩm PCR và vector tách dòng pBT có bazơ Thymine nhô ra ở đầu 3'.
Để tăng hiệu quả của quá trình tách dòng, chúng tôi tiến hành thôi gel chứa đoạn gen A và gen V1. Sau khi tinh sạch, chúng tôi thực hiện phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Thành phần của phản ứng gắn đƣợc trình bày ở bảng 2.7 (2.2.5), hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng khoảng từ 20-30 phút. Sản phẩm nối ghép sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung Carbenicilin 50 mg/l, X-gal (0,04%) và chất cảm ứng IPTG 0,1M. Hình 3.3 là kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α với mẫu thu đƣợc ở Bắc Giang, các mẫu khác cũng cho kết quả tƣơng tự. Kết quả thu đƣợc có thể giải thích nhƣ sau: toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có Carbenicilin đều là khuẩn lạc mang plasmid. Vì sự có mặt của gen kháng carbenicilin trong plasmid mang đến cho vi khuẩn tính kháng Carbenicilin. Các khuẩn lạc xanh là do trong vector pBT có chứa gen lacZ nếu hoạt động bình thƣờng sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase và dƣới sự cảm ứng của IPTG chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Các khuẩn lạc trắng là do gen lacZ đã bị một đoạn DNA xen vào giữa dẫn đến không tổng hợp đƣợc enzym β-galactosidase. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn DNA tƣơng ứng. Cũng có thể xảy ra trƣờng hợp sau khi bị đứt gãy các plasmid tự đóng vòng cũng không có khả năng tổng hợp enzym β-galactosidase do đó các khuẩn lạc này