cây phát sinh chủng loại
Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Maximum Parsimony (MP) sử dụng ClustalW/DNAstar để so sánh các trình tự gen virus của ba tỉnh phân lập đƣợc với 47 trình tự gen của các loài Begomovirus khác nhau trên thế giới đƣợc công bố trên Ngân hàng gen (NCBI).
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony) dựa trên
việc so sánh trình tự gen của 3 thể phân lập HN, BG, LS với 47 trình tự gen của các loài Begomovirus khác trên thế giới.
*Chú thích: ToLCVnV-Tomato leaf curl Vietnam virus, ToLCHnV-Tomato leaf curl Hainan virus, ToLCHNV- Tomato leaf curl Hanoi virus, PaLCCNV-Papaya leaf curl China virus, KuMV-Kuzud mosaic virus. Virus OW và NW- tƣơng ứng là những loài virus thuộc nhóm virus Old Word và New Wor
Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0 44.0 5 10 15 20 25 30 35 40 GQ870288 - ToLCVnV FN434083 - ToLCHnV HQ162268 - ToLCHnV 100.0 99.9 BG 71.8 HN HQ162270 - ToLCHNV 100.0 42.9 DQ641700 - PaLCCNV JF682837 - PaLCCNV 98.7 LS 100.0 AJ558116 99.9 AJ558117 JX555979 100.0 AJ704604 99.7 99.2 AJ876548 99.4 66.3 AJ851005 66.3 AF414287 DQ641698 100.0 EU368372 45.2 GU723708 55.9 86.9 DQ641695 85.6 AJ810096 DQ641696 100.0 AJ810157 59.3 NA AJ849916 X74516 100.0 JN809812 99.6 AF195782 AF327436 100.0 37.8 36.1 AJ438936 DQ641701 100.0 DQ641699 51.5 46.3 AY514630 GU723734 99.9 AJ420319 100.0 AY234383 99.1 AJ566744 81.6 32.4 AJ002459 AJ314739 97.2 AM050730 67.7 77.9 AB116629 S53251 62.2 78.2 M88179 X99550 94.8 X15983 90.6 AF012300 100.0 AF132852 78.3 AF239671 100.0 100.0 DQ641690 - KuMV Virus O W Vi rus N W
Qua hình 3.11 thấy rằng cây phát sinh chủng loại chia làm 2 nhánh chính: nhánh thứ nhất là loài Kuzud mosaic virus có quan hệ họ hàng xa nhất với các
loài còn lại. Nhánh thứ hai gồm các trình tự gen của các loài Begomovirus còn
lại, trong nhánh chia làm hai nhánh nhỏ là OW và NW viruses. Và ba thể phân lập ở Việt Nam đều nằm cùng nhánh với các loài virus thuộc nhóm virus OW, chứng tỏ chúng thuộc nhóm virus OW. Trong đó, thể phân lập LS có quan hệ gần gũi nhất với các thể phân lập/dòng Papaya leaf curl China virus với độ
tƣơng đồng di truyền khá cao trên 98%, cao nhất là 98,4% khi so sánh với thể phân lập Papaya leaf curl China virus mã số DQ641700 phân lập trên cây thuốc lá thu thập tại Hà Nội (Hà Tây cũ) ở Việt Nam. Trong khi đó, cũng tại địa điểm này, trên cây thuốc lá, chúng tôi lại phân lập đƣợc virus (thể phân lập HN) có quan hệ gần gũi nhất với thể phân lập/dòng Tomato leaf curl Hanoi virus (mã số HQ162270) với hệ số tƣơng đồng di truyền cũng khá cao (97,4%). Còn thể phân lập BG có quan hệ gần gũi nhất với thể phân lập/dòng Tomato leaf curl Hainan
virus có mã số FN434083 phân lập ở Trung Quốc với hệ số tƣơng đồng di
truyền 92,5%.
Nhƣ vậy, kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng tƣơng thích với kết quả so sánh độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide. Độ tƣơng đồng của các thể phân lập Việt Nam nghiên cứu so với các loài Begomovirus gần nhất trên thế
giới đều trên 92%. Theo tiêu chuẩn của Ủy ban Quốc tế về phân loại virus (International committee on Taxonomy of Viruse, ICTV) đối với chi
Begomovirus thì hai dòng virus có độ tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide trên 90% thì có thể coi là cùng một loài [10]. Vì vậy, không có loài virus mới nào đƣợc tìm thấy trong 3 mẫu nghiên cứu.
Begomovirus là chi có sự đa dạng về trình tự genome DNA-A rất lớn (dao
động từ 60-100%). Sự đa dạng này giúp cho virus có thể thích nghi trong những điều kiện môi trƣờng sống khác nhau. Ba thể phân lập nghiên cứu thuộc ba loài virus Papaya leaf curl China virus, Tomato leaf curl Hainan virus và Tomato leaf curl Hanoi virus trong chi Begomovirus. Điều này chứng tỏ, mỗi cây trồng
có thể nhiễm một hay nhiều loại virus và ngƣợc lại mỗi virus có thể gây bệnh trên nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau. Kết quả nghiên cứu này cũng đóng góp thêm vào dữ liệu trình tự gen vòng DNA-A ở Việt Nam cũng nhƣ thế giới.
Tuy nhiên, để có thể tạo ra cây chuyển gen có phổ kháng rộng với các loại TLCV thì cần tiến hành các nghiên cứu một cách toàn diện hơn về tính đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh xoăn lá thuốc lá trên nhiều vùng khác nhau của Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1) Nhân dòng và xác định trình tự thành công toàn bộ vòng DNA-A của các dòng virus gây bệnh xoăn lá trên cây thuốc lá thu thập ở 3 tỉnh miền Bắc Việt Nam bao gồm Bắc Giang-BG (2747 nucleotide), Lạng Sơn-LS (2756 nucleotide), Hà Nội (Ba Vì)-HN (2738 nucleotide).
2) Độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của ba thể phân lập HN, BG, LS so với nhau dao động từ 87% đến 92,2%, còn so với các trình tự công bố trên GenBank dao động từ 61,8% đến 98,4%.
3) Ba thể phân lập nghiên cứu thuộc nhóm OW và là ba loài khác nhau trong chi Begomovirus: BG - Tomato leaf curl Hainan virus, HN - Tomato leaf curl Hanoi virus, LS - Papaya leaf curl China virus.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục thu thập và tách dòng gen các dòng virus TLCV ở các địa phƣơng khác để có một đánh giá tổng thể về các virus gây bệnh xoăn lá trên cây thuốc lá ở Việt Nam và tạo cơ sở cho việc xây dựng chiến lƣợc tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh xoăn lá.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Chu Hoàng Hà (2010)Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virusgây ra bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi). Báo cáo tổng kết đề tài.
2. Nguyền Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2008) Phân lập gen mã hóa Protein vỏ của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua thu thập trên cây cà chua dại tại tỉnh Thái Nguyên. Tạp chí Công nghệ
Sinh học6(4): 467-474.
Tài liệu tiếng Anh
1. Abhary MK, Anfoka GH, Nakhala MK, Maxwell DP (2006) Post- transcriptional gene silencing in controlling viruses of the Tomato yellow leaf curl virus complex. Arch Virol 151: 2349-2363.
2. Antignus Y, Lapidot M, Ganaim N, Cohen J, Lachman O, Pearlsman A, Raccah B and Gera A (1997) Biological and molecular characterization of tomato spotted wilt virus in Israel. Phytoparasitica 25: 319-330
3. Arguello-Astorga GR & Ruiz-Medrano R (2001) An iteron-related domain is associated to motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting amino acid-base pairs by a comparative approach. Arch
Virol 146: 1465-1485.
4. Bagewadi B, Chen S, Lal SK, Choudhury NR & Mukherjee SK (2004) PCNA interacts with Indian mung bean yellow mosaic virus Rep DNA downregulates Rep activity. J Virol 78(21): 11890-11903.
5. Baulcombe DC (1996) Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in trangenic plants. Plant Cell 8: 1833-1844.
6. Bbyrne DN, DNA Bellows TS (1991) Whitefly biology. Ann Rev Entomol 36: 431-457.
7. Boonham N, Walsh K, Hims M, Preston S, North J and Barker I (2002) Biological and sequence comparisons of Potato virus Y isolates associated with potato tuber necrotic ringspot disease. Plant Pathol 51:117-126.
8. Briddon RW, Bull SE, Amin I, Mansoor S, Bedford ID, Rish N, Siwatch SS, Zafar Y, Abdel-Salam AM, Markham PG (2004) Diversity of DNA1: a satellite- like molecule associated with monopartite-DNAβ complexes. Virology 324: 462-474.
9. Brigneti GO, Voinnet WX, Li LH, Ji SW, Ding and Baulcombe DC (1998) Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in
Nicotiana benthaniana. EMBL J 17: 6739-6746.
10. Fauquet CM, Bridon RW, Brown JK, Moriones E, Stanley J, M Zerbini M, Zhou X (2008) Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Arch Virol 153: 783-821.
11. Chowda RV, Colvin J, Muniyapa V, Seal S (2005) Diversity DNA distribution of Begomoviruses infecting tomato in India. Arch Virol 150: 845- 867.
12. Day AG, Bejarono ER, Buck KW, Burrell M, Lichtenstein CP (1991) Expression of an antisense viral gene in transgenic tobacco confers resistance to the DNA virus tomato golden mosaic virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88: 6721-6725.
13. Dry IB, Krake LR, Rigden JE & Rezaian MA (1997) A novel suHNiral agent associated with a geminivirus: the first report of a DNA satellite. Proc
Natl Acad Sci USA 94: 7088-7093.
14. Elmer JS, Sunter (1988) Genetic analysis of the tomato golden mosaic virus.
Nucleic Acids Research 16: 7043-7060.
15. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE & Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-strandedRNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
16. Gafni Y (2003) Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular dynamics of a plant DNA virus. Mol Plant Pathol 4: 9-15.
17. Gafni Y & Epel B (2002) The role of host DNA viral proteins in intra- DNA inter-cellular trafficking of geminiviruses. Physiol Mol Plant Pathol 60: 231- 241.
18. Gallitelli D (2000) “The ecology of cucumber mosaic virus and sustainable agriculture”. Virus Res 71: 9-21.
19. Gonsalves D, Gonsalves C, Ferreira S, Pitz K, Fitch M, Manshardt R, and Slightom J (2004) Transgenic virus resistant papaya: From Hope to Reality for Controlling of Papaya ringspot virus in Hawaii. Online. APSnet feature, American Phytopathological Society.
20. Ha C, Coomb S, Revill P, Harding R, Vu M, Dale J (2008) Molecular characterization of begomoviruses DNA DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation. J Gen Virol 89: 313-326.
21. Hanley-Bowdoin L, Settlage SB, Orozco BM, Nagar S, Robertson D (1999) Geminivirus: models for plant DNA replication, transcription, DNA cell cycle regulation. Crit Rev Plant Sci 18: 71-106.
22. Hull R & Covey SN (1983) Does cauliflower mosaic virus replicate by reverse transcription?. Trends in Biochemical Sciences 8: 119-121.
23. Jones DR (2003) Plant viruses transnmitted by whiteflies. European Journal
of Plant Pathology 109: 195-219.
24. Laufs J, Traut W, Heyraud F, Matzeit V, Rogers SG, Schell J. & Gronenborn B (1995) A DNA structure is required for geminivirus replication origin function. J Virol 70: 148-158.
25. Lazarowitz SG (1992) Geminiviruses: genome structure DNA gene function.
Crit Rev Plant Sci 11: 327-349
26. Malyshenko SI, Kondakova OA, Navarova JK (1993) Reduction of tobacco mosaic virus accumlation in transgenic plants producing non-functional viral transport proteins. Journal of General Virology 74: 1149-1156.
27. Orozco BM & Hanley-Bowdoin L (1996) A DNA structure is required for geminivirus replication origin function. J Virol 70: 148-158.
28. Padidam M, Sawyer S & Fauquet CM (1999) Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination. Virology 265: 218-225.
29. Palukaitis P, Roossinck MJ, Dietzgen RG and Francki RI (1992) “Cucumber mosaic virus”. Adv Virus Res 4: 281-348.
30. Pfeiffer P & Hohn T (1983) Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: a detailed model and test of some aspects. Cell 33: 781-789.
31. Pilowsky M, Cohen S (1990) Tolerance to tomato yellow leaf curl virus derived from Lycopersicon peruvianum. Plant Disease 74: 248-250.
32. Rojas MR, Gilbertson RL, Russel DR & Maxwell DP (1993) Use of degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly- transmitted geminivirus. Plant Disease 77: 340-347.
33. Roger Beachy (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation. PhilTrans R Soc Lond B 354: 659-664.
34. Rom M, Antignus Y, Gidoni D, Pilowsky M, Cohen S (1993) Accumulation of tomato yellow leaf curl virus DNA in tolerant DNA susceptible tomato lines.
Plant Diesease 77: 253-257.
35. Rybicky EP & Pietersen G (1999) Plant virus disease problems in the developing world. InAdvances in Virus Research 53: 127-178.
36. Saeed M, Behjatnia SA, Mansoor S, Zafar Y, Hasnain S. & Rezaian MA (2005) A single complementary-sense transcript of a geminiviral DNA β satellite is determinant of pathogenicity. Mol Plant Microbe
Interact 18: 7-14.
37. Shew HD and Lucas GB (1991) Compendium of Tobacco Diseases. APS Press, St. Paul. 90
38. Shivaprasad PV, Akbergenov R, Trinks D, Rajeswaran R, Veluthambi K, Hohn, T & Poggin, MM (2005) Promoters, transcripts, DNA regulatory proteins of mungbean yellow mosaic geminivirus. J Virol 79: 8149-8163.
39. Sinisterra XH, Polston JE, Abouzid AM, Hiebert E (1999) Tobacco plants transformed with a modified coat protein of tomato mottle begomovirus show resistance to virus infection. Phytopathology 89: 701-706.
40. Stanley J, Bisaro DM, Briddon RW, Brown JK, Fauquet CM, Harrison BD, Rybicki EP & Stenger DC (2005) Family Geminiviridae. In Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. 301- 326.
41. Tatineni S, Dawson WO (2012) Enhancement or attenuation of disease by deletion of genes from Citrus tristeza virus. J Virol86(15): 7850-7857
42. Van Wezel R, Dong X, Blake P, Stanley J & Hong Y (2003) Differential roles of geminivirus Rep DNA AC4 (C4) in the induction of necrosis in Nicotiana benthamiana. Mol Plant Pathol 3: 461-471.
43. Van Wyk B, van Oudtshoorn B, Gericke N (1997) Medicinal Plants of South Africa. Briza, Pretoria.
44. Wartig, Kheyr Pour, Noris, de Kouchkovsky, Jouanneau, Gronenborn & Jupin (1997) Genetic analysis of the monopartite tomato yellow leaf curl geminivirus: roles of V1, V2, and C2 ORFs in viral pathogenesis. Virology 228: 132-137. 45. Yang Y, Polston TE, Patte CP, Hiebert E, Shernood TA (2004) Use of TYLCV rep gen sequence to engineer TYLCV resistance in tomato.