Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pBT. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành liên kết photphodieste giữa đầu A sản phẩm PCR và vector tách dòng pBT có bazơ Thymine nhô ra ở đầu 3'.
Để tăng hiệu quả của quá trình tách dòng, chúng tôi tiến hành thôi gel chứa đoạn gen A và gen V1. Sau khi tinh sạch, chúng tôi thực hiện phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Thành phần của phản ứng gắn đƣợc trình bày ở bảng 2.7 (2.2.5), hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng khoảng từ 20-30 phút. Sản phẩm nối ghép sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung Carbenicilin 50 mg/l, X-gal (0,04%) và chất cảm ứng IPTG 0,1M. Hình 3.3 là kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α với mẫu thu đƣợc ở Bắc Giang, các mẫu khác cũng cho kết quả tƣơng tự. Kết quả thu đƣợc có thể giải thích nhƣ sau: toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có Carbenicilin đều là khuẩn lạc mang plasmid. Vì sự có mặt của gen kháng carbenicilin trong plasmid mang đến cho vi khuẩn tính kháng Carbenicilin. Các khuẩn lạc xanh là do trong vector pBT có chứa gen lacZ nếu hoạt động bình thƣờng sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase và dƣới sự cảm ứng của IPTG chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Các khuẩn lạc trắng là do gen lacZ đã bị một đoạn DNA xen vào giữa dẫn đến không tổng hợp đƣợc enzym β-galactosidase. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn DNA tƣơng ứng. Cũng có thể xảy ra trƣờng hợp sau khi bị đứt gãy các plasmid tự đóng vòng cũng không có khả năng tổng hợp enzym β-galactosidase do đó các khuẩn lạc này
cũng có màu trắng. Tuy vậy, việc chọn các khuẩn lạc trắng để tiến hành nghiên cứu đã loại bỏ đƣợc phần lớn các trƣờng hợp không mong muốn. Chúng tôi tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc trắng bằng kĩ thuật colony-PCR để có thể thu đƣợc dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn.
Hình 3.3: Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli
chủng DH5α. Các khuẩn lạc xanh mang plasmid pBT, các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp.