Hình 3.5: Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự
1-3: Plasmid chứa đoạn A; 4-6: Plasmid chứa đoạn V1; 1, 4: BG; 2, 5: HN; 3, 6: LS Sau khi chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các giếng sản phẩm colony- PCRcó kích thƣớc phù hợp theo lý thuyết và nuôi trong 5 ml LB lỏng trong 16 giờ,chúng tôi tiến hành tách plasmid theo quy trình nhƣ đã trình bầy ở mục 2.2.8.
Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.65) cho thấy đảm bảo số lƣợng và chất lƣợng phục vụ cho đọc trình tự.
Mặc dù vậy, trong quá trình gắn sản phẩm PCR vào vector, có thể có một số sản phẩm phụ cũng đƣợc gắn vào vector. Tức là, có những đoạn có kích thƣớc lớn hơn hoặc nhỏ hơn đoạn gen quan tâm. Do đó, cần phải kiểm tra sản phẩm plasmid đã chọn bằng phƣơng pháp cắt enzyme giới hạn. Dựa vào bản đồ vector pBT có 2 điểm cắt của BamHI nằm trong vùng cắt đa vị trí. Do đó, chúng tôi sử dụng
enzyme BamHI để cắt plasmid tái tổ hợp thành vector và đoạn DNA ngoại lai riêng rẽ. Sau khi cắt, sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di đƣợc trình bày ở hình 3.76.
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng BamHI. M: Marker 1 Kb; Giếng số 1-2: Plasmid mang gen V1; Giếng số 3-4: Plasmid mang gen A. M: Marker 1 Kb; Giếng số 1-2: Plasmid mang gen V1; Giếng số 3-4: Plasmid mang gen A.
Ảnh điện di sản phẩm cắt trên hình 3.7 6 cho thấy, tại các giếng số 1, 2, 3, 4 các plasmid tái tổ hợp đƣợc tách từ khuẩn lạc trắng sau khi đƣợc cắt bằng enzyme BamHI đều xuất hiện 2 băng khác nhau: Một băng ở phía trên có kích thƣớc khoảng 2,7 kb phù hợp với kích thƣớc của vector pBT và một băng ở phía dƣới có kích thƣớc khoảng 500 bp và 2300 bp phù hợp với kích thƣớc đoạn gen quan tâm. Nhƣ vậy, có thể khẳng định là việc nối ghép sản phẩm tách dòng với vector tách dòng pBT đã đạt đƣợc kết quả mong muốn.
M 1 2 3 4 ~2,7 Kb ~2,3 Kb ~0,5 Kb 1 Kb 3 Kb 2.5 Kb Comment [SCD22]: BamHI
Để khẳng định chắc chắn các dòng gen thu đƣợc là gen V1 và A, chúng tôi tiến hành tinh sạch các dòng plasmid tái tổ hợp và giải trình tự gen.