(Nguồn: http://ag.arizona.educropcottoninsectswfhorticultura0204.html
1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây trồng chuyển gen kháng Begomovirus trồng chuyển gen kháng Begomovirus
Dựa vào phân tích phân tử, Việt Nam đã phát hiện đƣợc19 loài
begomovirus:
Loài đã đƣợc công bố: Squash leaf curl China virus (SLCCV) trên họ bầu bí; Loofa yellow mosaic virus (LYMV) trên họ bầu bí (Revill et al.,2003);
Tomato yellow leaf curl VietNam virus (ToLCVV); Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKV) trên cây cà chua (Green et al., 2001); Papaya
leaf curl China virus (PaLCuCNV) trên cây thuốc lá; Lindernia anagallis yellow vein virus (LaYVV) trên cây lữ đằng; Alternanthera yellow vein virus (AlYVV) trên hoa dina, nhọ nồi; Sida leaf curl virus (SiLCV) trên cây cối xay; Ludwigia yellow vein virus (LuYVV) trên cây rau mƣơng.
Loài chƣa công bố: Corchorus golden mosaic virus (CoGMV) trên cây rau đay; Kudzu mosaic virus (KuMV) trên cây sắn dây; Clerodendrum golden mosaic virus (ClGMV) trên cây mò hoa trắng; Spilanthes yellow vein virus (SpYVV) trên cây cúc nút áo; Mimosa yellow leaf curl virus (MiLVV) trên cây trinh nữ móc; Sida yellow vein Vietnam virus (SiYVVNV) trên cây ké hoa vàng; Tomato leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) trên cây cà chua; Erectites yellow mosaic virus (ErYMV) trên cây rau tàu bay; Ludwigia yellow vein Vietnam virus (LuYVVNV) trên cây rau mƣơng [20].
Vấn đề nghiên cứu đa dạng thành phần các loài Begomovirus đƣợc thực hiện trên nhiều quốc gia nhƣ Mỹ, Trung Quốc, Thái Lan... Trên thế giới hiện nay đã phát hiện đƣợc hơn 200 loài Begomovirus trên nhiều đối tƣợng vật chủ
khác nhau. Và gây thiệt hại kinh tế đáng kể đối với một số cây trồng quan trọng nhƣ: cà chua, thuốc lá, đậu, bông...
Ở Việt Nam Begomovirus gây thiệt hại chủ yếu các đối tƣợng nhƣ cà
chua, thuốc lá. Việc sử dụng các giống thuốc lá kháng Begomovirus là cách tiếp cận tốt nhất để giảm thiệt hại do Begomovirus. Tuy nhiên, cho đến nay việc tạo ra cây thuốc lá chuyển gen kháng TLCV còn hạn chế. Mặt khác đã có rất nhiều nghiên cứu về loài Begomovirus khác nhƣ TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) - virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua. Giống cà chua kháng TYLCV đầu tiên đƣợc tạo ra là kết quả của lai giống gen kháng TY20 có nguồn gốc từ L. peruvianum [31], [34]. Ngoài ra, gen kháng TY-1 cũng đã đƣợc sử dụng thành
công để kháng lại Tomato yellow mosaic virus (ToYMV) và Tomato mottle virus (ToMoV) [20].
Các nhà nghiên cứu [45] đã thành công khi sử dụng gen C4 của TYLCV trên đối tƣợng cây cà chua. Một số nghiên cứu khác [1] đã đƣa ra những bằng chứng thuyết phục về sự hiệu quả của cơ chế câm gen sau phiên mã (PTGS) trong việc kháng lại virus gây bệnh xoăn lá cà chua TYLCV.
Tuy nhiên, những giống kháng thƣơng mại tạo ra bằng lai giống bị hạn chế bởi trong kiểu gen thƣờng mang những gen không mong muốn và quá trình đƣa một gen kháng từ một giống hoang dại vào một giống thƣơng mại thƣờng rất mất thời gian và phức tạp do liên quan đến cơ chế di truyền của toàn bộ genome.
Hiện nay, chuyển gen tạo cây kháng đang là giải pháp hiệu quả nhất. Cây kháng đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật di truyền có nhiều lợi thế hơn các cây kháng thu đƣợc từ lai giống các gen của bộ gen thực vật. Trong thực tế, một số cây trồng chuyển gen kháng virus đã đƣợc phát triển bằng cách sử dụng một trình tự của genome virus trong thay đổi vật chất di truyền cây trồng. Khái niệm này đƣợc gọi là tính kháng có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh (PDR) [5]. Cho đến nay, sử dụng PDR trong việc nâng cao sức đề kháng của thuốc lá chống lại TLCV cũng nhƣ các Begomovirus khác đã cho thấy đây là một phƣơng pháp
triển vọng. Để tạo cây trồng kháng với TLCV có thể tác động vào các đích sau: (1) tác động đến protein vỏ [39] (2) tạo cây kháng thông qua ức chế protein vận chuyển [26], (3) làm thay đổi DNA, (4) sử dụng các gene antisense [12] và (5) sử dụng các gen chức năng đã bị cắt ngắn hoặc đột biến để chuyển vào cây trồng [44], [45]. Trong thực tế, một số giống kháng đã đƣợc tạo ra bởi cách tiếp cận này đã cho thấy khả năng xây dựng tính kháng có thể trở thành nền tảng cho các chƣơng trình quản lý Begomovirus trên toàn thế giới.
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguồn vật liệu
Nguồn thực vật: Các mẫu lá thuốc lá nghi nhiễm bệnh xoăn lá đƣợc thu từ 3 tỉnh Bắc Giang, Hà Nội và Lạng Sơn do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Bảng 2.1: Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu
STT Tên tỉnh thu mẫu Kí hiệu mẫu
1 Bắc Giang BG
2 Hà Nội HN
3 Lạng Sơn LS
2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit
- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α
- Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit-QIAGEN) - Kit tách chiết plasmid
- Vector pBT (Viện Công nghệ sinh học)
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị
- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, KCl, Tris HCl, EDTA…
Ethanol 70%, Nƣớc khử ion. Kháng sinh Carbenicillin. Enzyme giới hạn
BamHI, Taq DNA polymerase của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck,
Sigma, Amersham …
- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học.
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các bƣớc tiến hành thí nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ đồ sau
Sơ đồ thí nghiệm
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của lá thuốc lá nhiễm bệnh đƣợc tách theo phƣơng pháp của Accotto và cộng sự (2000).
- Nghiền 0,15 g lá nhiễm bệnh trong nitơ lỏng.
- Bổ sung 500 μl đệm chiết, đảo đều. Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 5 phút. - Bổ sung 500 μl Kaliacetat 5M. Ủ 0oC trong 10 phút. Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút.
- Chuyển khoảng 500 μl dịch nổi sang eppendorf mới. Tách chiết DNA tổng số
Phân tích trình tự và đánh giá đa dạng di truyền
Chọn dòng và tách plasmid Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu
Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào
E.coli DH5α
- Bổ sung 500 μl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). Đảo đều hỗn hợp, li tâm 13.000 v/p trong 15 phút. Chuyển 350 μl pha trên sang eppendorf mới.
- Bổ sung thêm 350 μl Isopropanol lạnh, đảo đều. Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút.
- Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70%.
- Để khô tủa và hòa tan trong dH2O (có bổ sung Rnase).
*Đệm chiết: 100mM Tris HCl, pH=8; 50mM EDTA; 500 mM NaCl; 1% SDS; 10mM β-mercaptoethanol, hoặc axit citric 10mM.
2.2.2. Phản ứng PCR
Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần.