Bảng 2.2: Trình tự và thông số của hai mồi (Chu Hoàng Hà et al., 2006)
Tên mồi Trình tự mồi Tgm Mục đích Kích thƣớc (Nucleotide) prV324R 5'-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAN-3' 530C Nhân đoạn
gen V1
~500
prC889N 5'-GGRTTDGARGCATGHGTACATN-3'
TYLCV-A-F 5'-GGAACATCAGGGCTTTTGTA-3' 540C Nhân đoạn gen A
~2300 TYLCV-A-R 5'-CACACAGAGAATGCTCTGTT-3'
TYLCV-F2 5'-CTCACCTGCATGTCCTCATCN 520C Đọc trình tự
(Trong đó các ký hiệu Y, R, M, D, H, N thay thế cho các loại nucleotide: Y (C hoặc T), R (A hoặc G), M (A hoặc C), D (G hoặc C hoặc A), H (A hoặc C hoặc T), N (A hoặc G hoặc C hoặc T))
Quy trình - Cặp mồi prV324N/prC889N Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 prV324N (10 pmol/µl) 1 6 prC889N (10 pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3
Tổng 25
Bảng 2.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 53 45 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
- Cặp mồi TYLCV-A-F/TYLCV-A-R Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 TYLCV-A-F (10 pmol/µl) 1 6 TYLCV-A-R (10 pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3 Tổng 25
Bảng 2.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 53 45 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose
Quy trình
Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X đƣợc đun sôi, để nguội khoảng 50- 60oC, đổ dung dịch vào khay gel. Khi gel đông đặt khay gel vào bể điện di. Tra mẫu DNA trộn với đệm (tỉ lệ 5V mẫu:1V đệm) vào các giếng trên bản gel. Chạy với điện thế từ 80-120V. Quan sát các dải DNA bằng cách nhuộm gel vào dung
dịch EtBr 100 μl/l khoảng 10-15 phút. Sau đó rửa bản gel bằng nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại 300 nm.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quy trình
- Điện di sản phẩm PCR của gen quan tâm trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer theo tỷ lệ : Vmẫu:VBinding buffer = 1:1 ( 1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ 550
C trong 10-15 phút, đảo nhẹ cho đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp sang cột Qiaquick spin, ly tâm hỗn hợp 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, bổ sung 500 µl Wash buffer (hoặc ethanol 700), ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, tiếp tục ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. - Bổ sung 30 µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa màng lọc. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu DNA.
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT