STT Tên tỉnh thu mẫu Kí hiệu mẫu
1 Bắc Giang BG
2 Hà Nội HN
3 Lạng Sơn LS
2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit
- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α
- Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit-QIAGEN) - Kit tách chiết plasmid
- Vector pBT (Viện Công nghệ sinh học)
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị
- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, KCl, Tris HCl, EDTA…
Ethanol 70%, Nƣớc khử ion. Kháng sinh Carbenicillin. Enzyme giới hạn
BamHI, Taq DNA polymerase của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck,
Sigma, Amersham …
- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học.
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các bƣớc tiến hành thí nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ đồ sau
Sơ đồ thí nghiệm
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của lá thuốc lá nhiễm bệnh đƣợc tách theo phƣơng pháp của Accotto và cộng sự (2000).
- Nghiền 0,15 g lá nhiễm bệnh trong nitơ lỏng.
- Bổ sung 500 μl đệm chiết, đảo đều. Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 5 phút. - Bổ sung 500 μl Kaliacetat 5M. Ủ 0oC trong 10 phút. Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút.
- Chuyển khoảng 500 μl dịch nổi sang eppendorf mới. Tách chiết DNA tổng số
Phân tích trình tự và đánh giá đa dạng di truyền
Chọn dòng và tách plasmid Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu
Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào
E.coli DH5α
- Bổ sung 500 μl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). Đảo đều hỗn hợp, li tâm 13.000 v/p trong 15 phút. Chuyển 350 μl pha trên sang eppendorf mới.
- Bổ sung thêm 350 μl Isopropanol lạnh, đảo đều. Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút.
- Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70%.
- Để khô tủa và hòa tan trong dH2O (có bổ sung Rnase).
*Đệm chiết: 100mM Tris HCl, pH=8; 50mM EDTA; 500 mM NaCl; 1% SDS; 10mM β-mercaptoethanol, hoặc axit citric 10mM.
2.2.2. Phản ứng PCR
Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần.
Hình 2.1: Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV Bảng 2.2: Trình tự và thông số của hai mồi (Chu Hoàng Hà et al., 2006) Bảng 2.2: Trình tự và thông số của hai mồi (Chu Hoàng Hà et al., 2006)
Tên mồi Trình tự mồi Tgm Mục đích Kích thƣớc (Nucleotide) prV324R 5'-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAN-3' 530C Nhân đoạn
gen V1
~500
prC889N 5'-GGRTTDGARGCATGHGTACATN-3'
TYLCV-A-F 5'-GGAACATCAGGGCTTTTGTA-3' 540C Nhân đoạn gen A
~2300 TYLCV-A-R 5'-CACACAGAGAATGCTCTGTT-3'
TYLCV-F2 5'-CTCACCTGCATGTCCTCATCN 520C Đọc trình tự
(Trong đó các ký hiệu Y, R, M, D, H, N thay thế cho các loại nucleotide: Y (C hoặc T), R (A hoặc G), M (A hoặc C), D (G hoặc C hoặc A), H (A hoặc C hoặc T), N (A hoặc G hoặc C hoặc T))
Quy trình - Cặp mồi prV324N/prC889N Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 prV324N (10 pmol/µl) 1 6 prC889N (10 pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3
Tổng 25
Bảng 2.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 53 45 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
- Cặp mồi TYLCV-A-F/TYLCV-A-R Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 TYLCV-A-F (10 pmol/µl) 1 6 TYLCV-A-R (10 pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3 Tổng 25
Bảng 2.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 53 45 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose
Quy trình
Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X đƣợc đun sôi, để nguội khoảng 50- 60oC, đổ dung dịch vào khay gel. Khi gel đông đặt khay gel vào bể điện di. Tra mẫu DNA trộn với đệm (tỉ lệ 5V mẫu:1V đệm) vào các giếng trên bản gel. Chạy với điện thế từ 80-120V. Quan sát các dải DNA bằng cách nhuộm gel vào dung
dịch EtBr 100 μl/l khoảng 10-15 phút. Sau đó rửa bản gel bằng nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại 300 nm.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quy trình
- Điện di sản phẩm PCR của gen quan tâm trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer theo tỷ lệ : Vmẫu:VBinding buffer = 1:1 ( 1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ 550
C trong 10-15 phút, đảo nhẹ cho đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp sang cột Qiaquick spin, ly tâm hỗn hợp 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, bổ sung 500 µl Wash buffer (hoặc ethanol 700), ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, tiếp tục ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. - Bổ sung 30 µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa màng lọc. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút để thu DNA.
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT
Hình 2.2: Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hoàng et al, 2005)
pBT 2705bp
Bảng 2.7:. Thành phần phản ứng ghép nối STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 3 2 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 5 3 Vector pBT 1 4 T4 buffer 10X 1 5 T4 DNA ligase 1 Tổng thể tích 10 Quy trình
Sản phẩm thôi gel khi đƣợc gắn vào vector tách dòng dƣới sự xúc tác của T4 ligase và năng lƣợng ATP trong dung dịch đệm DNA đƣợc gắn vào vector pBT. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotide Adenin nhô ra ở đầu 3’ của sản phẩm PCR và nucleotide Thymine nhô ra ở đầu 5’ của vector. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C trong 2 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt phƣơng pháp sốc nhiệt
Quy trình
*Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
C.
- Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ
- Đo OD 600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15phút ở trong đá (hoặc ở 40
C).
- Ly tâm 4000 v/p ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút).
- Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100 ml LB ban đầu. - Bổ sung 15- 20% glycerol.
- Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840
C.
*Biến nạp: Sau khi đã gắn DNA vào vector pBT, tiến hành biến nạp sản phẩm gắn vào tế bào khả biến E.coli DH5α đã đƣợc chuẩn bị ở trên, gồm các bƣớc sau:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy ra khỏi tủ -840C, để ngay vào đá trong thời gian từ 10-15 phút.
- Bổ sung toàn bộ sản phẩm gắn vào các ống đựng tế bào khả biến, đảo nhẹ, để trong đá khoảng 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây. - Để tế bào trong đá 5 phút
- Bổ sung 200 µl LB lỏng vào mỗi ống tế bào khả biến. Để lại trong đá 5 phút.
- Sau đó nuôi lắc 220 v/p ở 370C trong thời gian 90 phút.
- Cấy trải 150-250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa carbenicillin 50 mg/l, IPTG 100 mM, X-Gal 0,04% rồi ủ 370C qua đêm.
2.2.7. Phản ứng colony-PCR
Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng colony-PCR STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 8 2 Buffer PCR (NH+4) 10 X 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2 5 pUC18-F1 (10pmol/µl) 1 6 pUC18-R1 (10pmol/µl) 1 7 Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,2 8 DNA khuôn 3
Tổng 20
Bảng 2.9: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 50 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml LB lỏng có bổ sung Carbenicillin 50 mg/l để tách plasmid.
2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid
Quy trình
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2 ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 200 µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 400 µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lƣợng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
-Thêm 300 µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nƣớc), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ 40C ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô DNA bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm vào 50 µl nƣớc khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan đến khi hoàn toàn. Plasmid có thể đƣợc bảo quản ở -200 C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI.
Quy trình
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 6,5 2 Buffer BamHI 1 3 Enzyme BamHI 0,5 4 Template 2 Tổng thể tích 10
- Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm cắt. - Tinh sạch plasmid và đem giải trình tự.
Comment [SCD14]: Isoamyl alcohol
2.2.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tựtƣơng ứng trên GenBank tƣơng ứng trên GenBank
Xác định trình tự nucleotide:
Chọn các mẫu plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu đƣợc qua so sánh các trình tự gen.
Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu được:
So sánh các trình tự thu đƣợc với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác nhận gen tách dòng đƣợc là đoạn gen quan tâm. Sau đó so sánh các trình tự gen ở các tỉnh thành khác nhau với nhau để đánh giá mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các thể phân lập và so sánh với các trình tự tƣơng ứng đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank).
Bảng 2.11: Bảng các mã số (GenBank ID), nguồn gốc các trình tự DNA-A của các chủng virus trên thế giới đƣợc sử dụng trong so sánh tạo cây phát sinh chủng loại
NEW WORLD VIRUSES
STT Loài Vật chủ Mã số
GenBank
Nguồn gốc đất nƣớc
1 Bean dwarf mosaic virus Bean M88179 Braxin 2 Sida golden mosaic Costa Rica virus Sida rhombifolia X99550 Costa Rica 3 Abutilon mosaic virus Abutilon sellovianum
Regel
X15983 Đức 4 Rhynchosia golden mosaic virus Rhynchosia minima AF239671 Honduras 5 Tomato mottle Taino virus Tomato AF012300 Mexico 6 Tomato golden mottle virus Tomato AF132852 Mỹ 7 Kudzu mosaic virus Kudzu DQ641690 Việt Nam
OLD WORLD VIRUSES
STT Loài Vật chủ Mã số
GenBank
Nguồn gốc đất nƣớc
1 Ageratum leaf curl virus Ageratum conyzoides AJ851005 Trung Quốc 2 Ageratum yellow vein virus Weed X74516 Singapore 3 Ageratum yellow vein virus Sauropus androgynus JN809812 Thái Lan 4 Ageratum yellow vein China virus Ageratum conyzoides AJ849916 Trung Quốc 4 Cotton leaf curl Multan virus Cotton AJ002459 Pakistan 5 Erectites yellow mosaic virus Fireweed DQ641698 Việt Nam 6 Eupatorium yellow vein virus Eupatorium makinoi AJ438936 Anh
7 Indian cassava mosaic virus Cassava AJ314739 Ấn Độ 8 Lindernia anagallis yellow vein
virus
False pimpernel DQ641701 Việt Nam 9 Ludwigia yellow vein Vietnam virus Primrose willow DQ641699 Việt Nam 10 Mimosa yellow leaf curl virus Mimosa DQ641695 Việt Nam 11 Papaya leaf curl China virus Corchoropsis timentosa AJ876548 Trung Quốc 12 Papaya leaf curl China virus Siegesbeckia orientalis JF682837 Trung Quốc 14 Papaya leaf curl China virus Tomato AJ558116 Trung Quốc 15 Papaya leaf curl China virus Tobacco DQ641700 Việt Nam 16 Papaya leaf curl China virus Tomato JX555979 Trung Quốc 17 Papaya leaf curl China virus Tomato AJ704604 Trung Quốc 18 Papaya leaf curl China virus Lycopersicon esculentum AJ558117 Trung Quốc 19 Pepper leaf curl virus Chilli AF414287 Malaysia 20 Sida leaf curl virus Sida cordifolia AM050730 Trung Quốc 21 Sida yellow mosaic virus Sida acuta AJ810096 Trung Quốc 22 Sida yellow vein Vietnam virus Arrow leaf DQ641696 Việt Nam 23 Squash leaf curl Yunnan virus Squash AJ420319 Trung Quốc 24 Stachytarpheta leaf curl virus Stachytarpheta AJ810157 Trung Quốc 25 Tobacco leaf curl Yunnan virus Tomato AJ566744 Trung Quốc 26 Tomato leaf curl Gujarat virus Tomato AY234383 NePan 27 Tomato leaf curl Hainan virus Tomato FN434083 Trung Quốc 28 Tomato leaf curl Hainan virus Papaya HQ162268 Việt Nam 29 Tomato leaf curl Hainan virus Papaya HQ162268 Việt Nam 30 Tomato leaf curl Hanoi virus Tomato HQ162270 Việt Nam 31 Tomato leaf curl Laos virus Tomato AF195782 Lào 32 Tomato leaf curl Malaysia virus Tomato AF327436 Malaisia 33 Tomato leaf curl Taiwan virus Tomato GU723708 Đài Loan 34 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ373254 Việt Nam 35 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato EU368372 Việt Nam 36 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ338766 Việt Nam 37 Tomato leaf curl Vietnam virus Tomato GQ870288 Việt Nam 38 Tomato leaf curl virus Tomato S53251 Mỹ 39 Tomato yellow leaf curl Thailand
virus
Tomato AY514630 Thái Lan 40 Tomato yellow leaf curl virus Tomato AB116629 Nhật Bản
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Genome của Tobacco leaf curl virus (TLCV) gồm 2 sợi DNA vòng đơn có chiều dài xấp xỉ 2700 nucleotide. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch DNA của TLCV. Để tách chiết DNA của TLCV chúng tôi sử dụng phƣơng pháp của Accotto và cộng sự (2000), với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Lá thuốc lá nhiễm bệnh đƣợc nghiền nhanh trong nitơ lỏng để giữ hoạt tính của DNA. Các hóa chất cần thiết (Extraction buffer)