p là tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tại các Nhà trẻ-Mẫu giáo có mang vi khuẩn
2.3.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu (thực hiện tại “Phòng
khuẩn hô hấp - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương”) 2.3.2.1. Lấy bệnh phẩm [117]
Bệnh phẩm là mẫu tăm bông ngoáy họng, được lấy ở họng miệng bằng tăm bông cán gỗ vô trùng.
Quy trình lấy bệnh phẩm: [89]
- Giải thích và hướng dẫn cho trẻ về việc lấy bệnh phẩm. Trong trường hợp, trẻ nhỏ phải có sự trợ giúp của cô giáo hoặc người chăm sóc.
- Đánh dấu ống nghiệm vô khuẩn sẽ đựng bệnh phẩm chứa tăm bông vô khuẩn dùng để lấy bệnh phẩm.
Hình 2.1: Cách lấy bệnh phẩm họng miệng (oropharyngeal swabs)
2.3.2.2. Phân lập và xác định biotype của các chủng Hib nghiên cứu
- Bảo bệnh nhân há miệng. Tay trái người lấy bệnh phẩm đè lưỡi sao cho có thể nhìn thấy 2 amidal và thành sau họng. Tay phải cầm tăm bụng ngoỏy ở 2 amidal và thành sau họng, không được chạm vào lưỡi, má hay răng.
- Dùng pippet vô trùng, với thao tác vô trùng cho vào ống nghiệm đựng tăm bông bệnh phẩm 1ml canh thang BHI.
- Cho tăm bụng đó lấy bệnh phẩm vào ống nghiệm vô khuẩn đã bổ sung canh thang BHI. Bệnh phẩm được giữ trong những ống nghiệm chứa
01ml canh thang BHI (Brain Heart Infusion) ở nhiệt độ phòng và vận chuyển bằng hộp lấy bệnh phẩm chuyên dụng trong vòng 4 giờ về phòng Thí nghiệm.
Phân lập vi khuẩn Hib :
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập Hib từ bệnh phẩm
- Ống nghiệm chứa tăm bông bệnh phẩm được lắc bằng máy Votex cho đến khi bệnh phẩm được giải phóng hết ra canh thang BHI. Sau đó, pha loãng canh thang bệnh phẩm theo 3 nồng độ tiếp theo lần lượt là 10-1, 10-2 và 10-3.
- Chia đĩa thạch chocolate (300àg bacitracin/ml) có bổ sung IsoVitalex thành 4 phần bằng nhau bằng bút viết kớnh kẻ ở đáy đĩa thạch.
- Đánh dấu đĩa thạch tương ứng với bệnh phẩm và từng nồng độ (100- chưa pha loãng, 10-1, 10-2 và 10-3) vào sau đĩa thạch bằng bút viết kính.
- Dùng que cấy đếm vô trùng cấy lần lượt từng nồng độ bệnh phẩm vào 1/4 đĩa thạch đã đánh dấu tương ứng. Để tủ ấm 370C, 5% CO2 18 – 24 giờ.
Thạch chocolate, ủ 18h ở 37oC với 5% CO 2
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm Gram
Xác định tính chất hoá sinh Ngưng kết với kháng huyết thanh mẫu
- Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, chọn khuẩn lạc nghi ngờ để xác định, với các đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ kích thước khoảng 1-2mm; tròn, vồng nhẹ, hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng và khụng gõy tan huyết.
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ và tiến hành nhuộm gram. Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram (-), đa hình thái, có thể ở dạng cầu trực khuẩn và kích thước nhỏ.
- Khẳng định vi khuẩn phân lập được là Hi bằng tính chất sinh hoá (test XV), như sau:
Lấy một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cấy vi khuẩn phân lập được (nghi ngờ là Hi) lên một nửa đĩa thạch bằng cách ria dày theo 3 hướng. Sau đó đặt các khoanh giấy X, V và XV lờn vựng nuôi cấy, khoảng cách giữa các khoanh giấy là 1,5 - 2,0 cm. Ủ ở 37oC với khí trường 5% CO2 qua đêm rồi đọc kết quả:
+ Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V thì đú chính là Hi, nếu chỉ mọc xung quanh V thì đó là
H. parainfluenzae.
+ Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy X và XV thì đó là H.
aphrophilus.
+ Nếu vi khuẩn mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V, cú gõy tan huyết thì đó là H. hemolyticus.
- Xác định serotype (typ huyết thanh) của Hib bằng phương pháp ngưng kết với kháng huyết thanh mẫu, theo phương pháp sau: [8], [117]
+ Cho vào ống nghiệm sạch 0,5ml formalin 0,5% và hoà một ăng vi
khuẩn để tạo thành huyền dịch.
+ Nhỏ một giọt huyền dịch vi khuẩn lên lam kính và một giọt kháng nguyên Poly, trộn đều bằng cách lắc nhẹ phiến kính, rồi quan sát bằng mắt thường. Nếu phản ứng với huyết thanh Poly dương tính (xuất hiện các hạt
ngưng kết trong vòng 1 phút): Thực hiện phản ứng ngưng kết với các typ huyết thanh b với cách làm tương tự như trên để xác định Hib. Nếu phản ứng với huyết thanh Poly âm tính (không xuất hiện các hạt ngưng kết trong vòng 1 phút), có nghĩa là vi khuẩn thuộc nhúm khụng xỏc định được typ huyết thanh, do vậy không cần thực hiện các phản ứng với các typ huyết thanh b.
Hình 2.2: Phản ứng ngưng kết huyết thanh trong định typ Hi
Xác định biotype của Hib :
Quy trình tiến hành bao gồm các bước [6],[87]:
- Hoà khuẩn lạc vi khuẩn vào 1 ml dung dịch NaCl 90/00 vô khuẩn rồi lắc tan thành huyền dịch để tạo huyền dịch khoảng 1-2 Mc Farland.
- Tạo hộp ẩm bằng cách nhỏ vài giọt nước sạch.
- Dùng pippett vô khuẩn hút huyền dịch, nhỏ vào 3 hốc cần làm phản ứng (Ure, Indol và ODC) của bộ sinh vật hoá học Api 10s (bioMộrieux).
- Để 24 giờ, sau đó đọc kết quả theo tiêu chuẩn của Kilian.
2.3.2.3. Xác định enzym β-lactamase của các chủng Hib [6], [87] - Xác định khả năng sinh enzym β-lactamase của Hib:
Để xác định khả năng này của vi khuẩn, chúng tôi sử dụng test thử
cefinase (Becton Dickinson). Quy trình tiến hành theo các bước sau:
+ Lấy một khoanh giấy cefinase từ lọ đựng, đặt vào đĩa Petri trống hoặc lam kính.
+ Tẩm ẩm khoanh giấy này bằng nước muối sinh lý vô trùng.
+ Sử dụng que cấy vô trùng hoặc que thủy tinh, lấy một khuẩn lạc và phết lên bề mặt khoanh giấy. Quan sát sự thay đổi mầu:
/ Nếu khoanh giấy chuyển từ mầu vàng sang mầu đỏ là (+). / Nếu khoanh giấy không chuyển mầu là (-).
2.3.2.4. Xác định gen mó hoỏ tổng hợp enzym β-lactamase (TEM hoặc ROB):
Được thực hiện với các chủng Hib có test cefinase (+), gồm các bước:
Tiến hành tách chiết ADN
Theo phương phỏp tỏch chiết nhanh ADN của Pitcher và cộng sự [88]: - Lấy khoảng 8 khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy vào trong 50µl nước cất hai lần vô trùng và khuấy đều bằng máy Vortex. Sau đó, đun sôi trong vòng 3 phút rồi ly tâm với 12.000/phút × 3 phút.
- Chuyển phần nước nổi 40µl (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới.
- ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ -700C nếu không tiến hành phản ứng ngay.
Tiến hành phản ứng PCR [6], [54], [87]
- Các cặp mồi (primer): cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán gen TEM và gen ROB.
- Quá trình khuyếch đại:
Phản ứng khuếch đại cho gen ROB và TEM đều có thể tích cuối cùng là 10µl, chứa: 50µM (mỗi) primer; 10mM deoxynucleotide triphosphates; 25mM MgCl2; 1µl (10 × reaction buffer); 0.5 U Taq ADN polymerase và 0,2 µl DNA mẫu. Quá trình khuếch đại gồm các thông số như sau: Sau bước biến tính ban đầu ở 94oC trong 5 phút, Giai đoạn 1: Biến tính: 94oC trong 30 giây; Giai đoạn 2: Gắn mồi: 55oC trong 30 giây; Giai đoạn 3: Kéo dài: 72oC trong
30giây. Quá trình này được thực hiện với 35 chu kỳ, sau đó được ủ 7 phút ở 72 oC và sau đó giữ ở 4oC cho đến khi phân tích [54].
Điện di
- Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1,5% với dung dịch đệm TAE.
- Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và
chứng dương.
- Điện di với hiệu điện thế 100V, cường độ 80mA, thời gian 20 phút. - Luụn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc
Nhuộm ADN và đọc kết quả
- Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide 1% pha loãng trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để khử Ethidium Bromide bỏm khụng đặc hiệu vào thạch. Sau khi nhuộm, các vạch ADN sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím.
- Đọc kết quả bằng máy chụp ảnh gel.
2.3.2.5. Xác định mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của các chủng Hib phõn lập được [87], [117]
- Xác định mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của các chủng Hib gõy bệnh bằng kỹ thuật E-test:
+ Chuẩn bị chủng Hib: tiến hành với chủng đã được định danh, thuần khiết và đã được nuôi cấy 18-24h trên môi trường chocolate. Hòa vi khuẩn vào 1 – 2ml nước muối sinh lý 0,9% vô trùng để sao cho có huyền dịch vi khuẩn tương ứng với độ đục 0,5 Mc Faland (Chú ý: nếu huyền dịch đục hơn ống độ đục chuẩn 0,5 Mc Faland thì cho thêm nước muối sinh lý 0,9% vô trùng. Ngược lại, nếu huyền dịch trong hơn ống độ đục chuẩn 0,5 Mc Faland thì cho thêm vi khuẩn Hib từ môi trường đã nuôi cấy).
+ Cấy vi khuẩn: láng huyền dịch vi khuẩn tương ứng độ đục 0,5 Mc
Faland lên bề mặt thạch chocolate Poly Vitex, dùng pipette Pasteur vô trùng loại bỏ huyền dịch vi khuẩn còn thừa ra khỏi đĩa thạch. Hoặc dùng tampon dàn đều vi khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 370C/15-30 phút.
+ Đặt thanh kháng sinh E-test: sử dụng dụng cụ đặt thanh E-test chuyên dụng (E-test applicator, hình 2.3) hoặc kẹp (forceps), đặt các thanh kháng sinh lên bề mặt môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn sao cho vạch chia MIC hướng lên trên, tức là hướng lên nắp của đĩa thạch và đầu có nồng độ cao nhất phải được đặt gần nhất với mép đĩa thạch (hình 2.3). Đảm bảo toàn bộ chiều dài của thanh kháng sinh tiếp xúc hết với bề mặt thạch. Nếu đặt thanh kháng sinh lộn ngược, kết quả sẽ không xuất hiện vòng ức chế hình elip vì kháng sinh không khuếch tán qua thanh nhựa (không có cấu trúc xốp). Nếu có túi khí ở dưới thanh kháng sinh, loại bỏ bằng cách ấn nhẹ kẹp vô trùng lên thanh kháng sinh (không được di chuyển thanh này), luôn luôn thực hiện từ nơi có nồng độ thấp nhất hướng lên trên.
Hình 2.3: Phương pháp đặt thanh E-test.
Chú ý: đặt thanh kháng sinh theo nguyên tắc: 5 thanh vào đĩa môi trường nuôi cấy đường kớnh 150 mm và 2 thanh kháng sinh vào đĩa môi trường nuôi cấy đường kớnh 90 mm.
Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 370C/CO2 (Để lật ngược nắp hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt thạch đó lỏng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả).
Hình 2.4: Các đặt các thanh E-test vào những đĩa thạch nuôi cấy có kích thước khác nhau.
+ Đọc kết quả: Sau 18 – 24 giờ ủ ấm, đọc giá trị MIC ở điểm giao nhau
của bờ vòng elip vô khuẩn với thanh kháng sinh, nếu điểm cuối hoàn toàn không có khuẩn lạc.
Hình 2.5: Ví dụ về cách đọc kết quả E-test: 2.5a (MIC 1àg/ml); 2.5b (MIC 4àg/ml)
Kết quả E-test sẽ được đánh giá bằng cách so sánh với bảng tiêu chuẩn của NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) để đánh giá mức độ nhạy cảm của kháng sinh đối với Hib.
- Xác định mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh thông dụng của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh bằng kỹ thuật Kirby – Bauer [117]:
+ Chuẩn bị chủng Hib(tương tự kỹ thuật E-test).
+ Cấy vi khuẩn (tương tự kỹ thuật E-test).
+ Đặt khoanh giấy kháng sinh: dùng dụng cụ đặt khoanh giấy hoặc panh kẹp hay kim tiêm vô trùng, để đặt khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cỏch mộp hộp lồng 1cm. Trong đó, hộp lồng tròn đường kính 90mm đặt tối đa 7 khoanh giấy (6 khoanh xung quanh và 1 khoanh ở giữa.
Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 370C/CO2 (Để lật ngược nắp hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt thạch đó lỏng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả).
+ Đọc kết quả: Sau 18 – 24 giờ ủ ấm, đọc kết quả bằng cách đo đường
kớnh vòng vô khuẩn của từng kháng sinh và so với bảng tiêu chuẩn của NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) để đánh giá mức độ nhạy cảm của kháng sinh đối với Hib ở 3 mức độ: S (nhạy - susceptible), I (trung gian - intermidiate) và R (kháng – resistant)
Hình 2.6: Ví dụ về cách đọc kết quả đĩa kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer.
2.3.2.6. Xác định genotype của các chủng Hib phân lập được bằng kỹ thuật PFGE [6], [87], [93]
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
- Nuôi cấy vi khuẩn trờn mụi trường thạch chocolate, sao cho có khuẩn lạc riêng rẽ.
- Sau 18 - 24 giờ lấy một khuẩn lạc đơn nuôi cấy tiếp trong canh thang (Tryticase soy có 5% Fildes), ủ qua đêm.
Các bước tiến hành
Kỹ thuật này được thực hiện trong 6 ngày, gồm các bước sau:
Ngày 1: (Khoảng 4 giờ): Hoà đều vi khuẩn vào trong thạch và ly giải vi khuẩn tại chỗ
- Chuẩn bị:
+ Thạch incert agarose 2% = 2g/100 ml = 200mg/100 ml (100mg/ 50ml nước cất hai lần) hấp cách thuỷ ở 105oC trong 1 phút; giữ lỏng ở 50oC trong nồi cách thuỷ.
+ EDTA: 2 ml/mẫu; đối với 10 mẫu = 20 ml, chuẩn bị 22 ml.
+ Dung dịch ly giải (lysis solution) + Lysozyme (2mg/ml): 1,0 ml/mẫu; đối với 10 mẫu = 10ml, chuẩn bị 12ml (24mg lysozyme trong 12ml dung dịch ly giải)
+ Huyền dịch vi khuẩn 5ml.
- Cách tiến hành:
+ Huyền dịch vi khuẩn được ly tâm ở 8000 vũng/phỳt × 5phút.
+ Loại bỏ nước nổi và tạo huyền dịch mới bằng 1ml EDTA; chuyển vào một tube nhỏ, trộn đều cẩn thận và ly tâm tiếp ở 8000 vũng/phỳt × 5phút.
+ Loại bỏ nước nổi và tạo huyền dịch mới bằng 1ml EDTA; trộn đều cẩn thận, sau đó ly tâm tiếp ở 8000 vũng/phỳt × 5phút.
+ Loại bỏ nước nổi và cho 130 µl Pett IV vào, sau đó trộn đều cẩn thận và giữ ở 37oC/1 giờ (có thể giữ ở 4oC một vài ngày trước khi tiếp tục làm).
+ Cho 130µl incert agarose 2% (đang được giữ lỏng ở nhiệt độ 55- 56oC trong nồi cách thủy) vào và trộn đều bằng máy Vortex, sau đó ly tâm rất nhanh để loại bọt khí. Ngay lập tức cho 200µl vào giếng của khuôn tạo cỏc nỳt thạch một cách cẩn thận (không được tạo ra bọt khí).
Chú ý: Cần thiết phải đánh đấu số bệnh phẩm vào bên cạnh cỏc nỳt thạch để tránh nhầm lẫn.
+ Để thạch trong khuôn đông lại ở nhiệt độ phòng 30-45 phút. Bước này có thể thực hiện nhanh hơn bằng cách để ở 4oC sau 20 phút.
+ Cắt cỏc nỳt thạch thành cỏc lỏt nhỏ hình chữ nhật bằng dụng cụ cắt chuyên dụng, cứ mỗi nút thạch thành 4 lát hình chữ nhật.
+ Cỏc lát thạch vừa cắt được cho vào một tube nhỏ đã đánh đấu có chứa 1,5ml Lysozyme + dung dịch ly giải.
+ Giữ ở 37oC trong nồi cách thủy qua đêm.
Ngày thứ 2: (Khoảng 30 phút)
Phân hủy protein
- Chuẩn bị:
+ Dung dịch ES: 1,5ml/mẫu.
+ Proteinase K: 1,0mg/1ml dung dịch ES, đối với 10 mẫu = 15ml, chuẩn bị 17ml.
- Cách tiến hành:
+ Dùng micropipet 1ml hút cẩn thận dung dịch (lysozyme + dung dịch ly giải) từ các tube để không vỡ các khối thạch.
+ Cho 1,5ml dung dịch ES + Proteinase K vào mỗi mẫu (tube) và ủ ở 50oC trong nồi cách thủy 15-48 giờ.
Kết thúc ngày thứ 2
Ngày thứ 3: (Khoảng 4 giờ)
Ngừng phân hủy protein và bảo quản cỏc nỳt thạch.
- Chuẩn bị:
+ Đệm TE: 1,5 ml/mẫu, ở bước này rửa trong TE lặp lại 3 lần; 10 mẫu = 1,5 × 3 ×10 + 45 ml; chuẩn bị 50 ml.
1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfloride) = 0,00017420 g/ml.
+ Dung dịch đệm TE + 1mM PMSF: 1,5 ml/mẫu, chuẩn bị 17 ml. Trong đó, 17 ml dung dịch này có chứa : 0,00017420 g × 17 = 0,0029614 g. Số lượng của PMSF này (0,0029614 g) được hòa trong 1ml cồn 100% và sau đó cho vào 16 ml TE để có 17 ml dung dịch.
- Cách tiến hành:
+ Hút bỏ dung dịch Proteinase K + ES.
+ Cho vào 1,5 ml dung dịch (đệm TE và 1mM PMSF), ủ ở nhiệt độ phòng để phản ứng sau 4 giờ.
