- Xỏc ủịnh sự tăng sinh khối callus trong mụi trường lỏng lắc bằng cỏch cõn trọng lượng callus trước và sau khi nuụi cấy, từ ủú tớnh hệ số tăng sinh
3. Phôi cam Valencia trên môi tr−ờng bổ sung Galactose 30mg/l
Galactose 30mg/l
3. Phôi cam Valencia trên môi tr−ờng bổ sung Galactose 30mg/l sung Galactose 30mg/l 3 2 1 0 20 40 60 80 100 15 30 50 80 15 30 50 80 15 30 50 80 15 30 50 80 10 20 40 60
Sucrose Glucose Galactose Lactose Glycerol
Cam Sành Cam Valencia
Số p h ô i h ìn h t h àn h Các loại đ−ờng khác nhau
Hình 3.15. ảnh h−ởng của các môi tr−ờng khác nhau đối với tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo phơi hố
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 76
3.4.1.2. Ảnh hưởng của ủiều kiện nuụi cấy ủến hỡnh thành phụi vụ tớnh ở
hai giống cam Sành và cam Valencia
Những callus thu ủược ở cỏc thớ nghiệm trờn ủược chỳng tụi tiếp tục sử dụng ủể tiến hành nuụi cấy trong cỏc ủiều kiện khỏc nhau, và thử nghiệm trờn cỏc mụi trường như sau:
- MT1: MT + 1mg/l BAP + 30g/l galactose + 0,5g/l ME+ 6g/l agar - MT2: MT + 2mg/l BAP + 30g/l galactose + 0,5g/l ME + 6g/l agar - MT1: MT + 1mg/l Kinetin + 30g/l galactose + 0,5g/l ME + 6g/l agar Tương tự với mụi trường ủặc, mụi trường lỏng sẽ khụng bổ sung agar. Kết
quả sau 6 tuần nuụi cấy 0,5g mụ sẹo ban ủầu ủược trỡnh bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nuụi cấy lỏng lắc ủến hỡnh thành phụi vụ tớnh
Giống Cam Sành Cam Valencia
MT1 77,21e 72,02ef MT2 60,17f 90,15h Mụi trường lỏng MT3 42,11g 33,12e MT1 51,23b 69,8c MT2 68,05a 86,01ab Mụi trường ủặc MT3 40,98bc 21,1d
Kết quả thớ nghiệm cho thấy mụi trường lỏng ảnh hưởng tương ủối
nhiều tới việc tới sự hỡnh thành phụi vụ tớnh ở cả hai giống cam Sành và cam Valencia, số phụi hỡnh thành nhiều hơn hẳn so với trờn mụi trường ủặc (khi
phõn tớch thống kờ ủều cho kết quả là P <0,05, tức cỏc yếu tố sai khỏc nhau cú ý nghĩa thống kờ với mức ý nghĩa α= 0,05). Một ủiều chỳng tụi thu ủược
trong quỏ trỡnh thớ nghiệm tạo phụi vụ tớnh ủú là trờn tất cả cỏc cụng thức sinh khối callus cũng tăng lờn so với ban ủầu, ủiều này cũng phự hợp với cỏc kết
quả của cỏc tỏc giả trước kia nghiờn cứu. Trờn mụi trường MT1 số phụi tạo thành là cao nhất với 77,21 phụi/0,5g callus (cam Sành). Cũn cam Valencia thỡ số phụi hỡnh thành cao nhất lại trờn MT2 với 90,15 phụi/50mg callus.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 77
Theo kết quả ở bảng 3.10 thỡ trờn mụi trường lỏng nhu cầu về CðHST cũng giảm so với trờn mụi trường ủặc, và ủõy cũng là ủiều ủỏng lưu ý trong
cỏc thớ nghiệm tạo phụi vụ tớnh ở cỏc giống khỏc nhau. ðiều này ủược giải
thớch là do trờn mụi trường lỏng, ủiều kiện thoỏng khớ cũng như tốc ủộ lắc 30 vũng/phỳt làm tăng khả năng hấp thu CðHST hơn trờn mụi trường ủặc, nú tạo
ủiều kiện cho cỏc mẫu hấp thu tối ủa cỏc chất trong mụi trường nuụi cấy. Tuy
nhiờn, mỗi giống khỏc nhau thỡ nhu cầu về hàm lượng CðHST cũng khỏc nhau, số phụi hỡnh thành cao nhất của cam Sành lại thu ủược trờn mụi trường chỉ bổ sung 1mg/l BAP, trong khi ủú với cam Valencia lại cần bổ sung BAP với lượng lớn hơn là 2mg/l.
Hỡnh 3.17. Phụi cam Sành hỡnh thành trờn mụi trường lỏng 0 20 40 60 80 100 MT1 MT2 MT3 MT1 MT2 MT3 Môi tr−ờng lỏng Môi tr−ờng đặc
Cam Sành Cam Valencia
Số p h ơ i h ìn h t h àn h ( ph ơ i)
Hình3.16. ảnh h−ởng của ni cấy lỏng lắc đến hình thành phơi vơ tính ở hai giống cam Sành và cam Valencia
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 78
Nhỡn chung mụi trường lỏng là ủiều kiện giỳp cho những mụ sẹo phụi
hoỏ hỡnh thành phụi vụ tớnh nhanh và nhiều hơn so với trờn mụi trường ủặc, là cơ sở cho việc tối ưu hoỏ quy trỡnh vi nhõn giống ở cỏc giống citrus núi chung và hai giống cam Sành và cam Valencia núi riờng.
Cỏc dạng phỏt sinh khỏc nhau của phụi vụ tớnh
Trong thớ nghiệm thu ủược nhiều dạng phụi khỏc nhau từ mụ sẹo phụi
hoỏ. Cú những phụi phỏt triển như phụi bỡnh thường qua cỏc giai ủoạn phụi
cầu, phụi tim, kộo dài trụ mầm, phỏt triển hai lỏ mầm rất rừ rệt, những phụi này khi nuụi cấy trờn mụi trường nảy mẩm phỏt triển thành cõy con bỡnh thường giống như cõy ủược gieo từ hạt. Nhưng cú những phụi bắt ủầu từ giai
ủoạn phụi cầu phỏt triển thành những kiểu hỡnh dị dạng với nhiều lỏ mầm và
lỏ mầm cú hỡnh dạng khụng bỡnh thường. Sự phỏt triển khụng bỡnh thường của phụi vụ tớnh cũng ủược thấy ở nhiều loài khỏc như khoai lang
(Padmanabhan et al., 1998), nguyờn nhõn cú thể do ủiều kiện nuụi cấy khụng thớch hợp. Sự thiếu hoặc thay ủổi của phụi vụ tớnh cú thể liờn quan ủến sự
khụng bỡnh thường của mụ phõn sinh chồi ủỉnh (Padmanabhan et al., 1998).
Sự hỡnh thành khụng bỡnh thường của vỏ phõn sinh ngọn cũng ủược mụ tả
như là nhõn tố quan trọng dẫn ủến kỡm hóm sự phỏt triển của phụi vụ tớnh
(Yeung, 1995).
Con ủường hỡnh thành phụi ủó ủược nghiờn cứu sõu ở cỏc cõy hai lỏ
mầm, ủặc biệt trờn ủối tượng cà rốt Daucus carota, cũn cỏc bỏo cỏo về tỏi
sinh phụi ở cõy một lỏ mầm lại tương ủối hạn chế, chủ yếu do bản chất khú
nuụi cấy hơn so với cõy hai lỏ mầm [39, 65]. Chỳng tụi ủó thu ủược một số
kết quả nghiờn cứu quan trọng trờn hai giống cam Sành và cam Valencia. Trong ủú, chỳng tụi ủó xỏc ủịnh ủược con ủường phỏt sinh phụi soma cũng
như cỏc biến ủổi hỡnh thỏi của phụi từ callus, cuối cựng là tạo cõy con hoàn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 79
Hỡnh 3.18 cho thấy ở giai ủoạn khởi ủầu phỏt sinh phụi, bề mặt cụm
callus trở nờn khụ hơn, sau ủú tế bào callus biệt hoỏ thành phụi hỡnh cầu,
những phụi này thường cú màu trắng nổi bật trờn nền callus. Phụi hỡnh cầu tiếp tục phỏt triển, kộo dài với một ủầu phỡnh hơn, cú dấu hiệu xẻ rónh ở phớa trờn. Vào cuối giai ủoạn này, phụi cú dạng ủặc trưng gồm bao lỏ mầm ụm lấy tiền lỏ mầm ở trong. Khi chuyển những phụi này từ mụi trường cú CðHST
thớch hợp thỡ nú sẽ phỏt triển nhanh, phần gốc sẽ lớn chuyển sang màu vàng sẫm hơn, từ ủú xuất hiện rễ ủầu tiờn, ủỏnh dấu sự nảy mầm của phụi thành
cõy con hoàn chỉnh. Cỏc cõy này sẽ chuyển sang giỏ thể ủể hoàn thiện quy
trỡnh vi nhõn giống.
Hỡnh 3.18. Quỏ trỡnh phỏt sinh phụi từ callus phụi hoỏ của Cam sành và Cam Valencia