- Xỏc ủịnh sự tăng sinh khối callus trong mụi trường lỏng lắc bằng cỏch cõn trọng lượng callus trước và sau khi nuụi cấy, từ ủú tớnh hệ số tăng sinh
2. Callus Valencia cứng trờn mụi trường cú bổ sung 2mg/l 2,4D và 2mg/l Kinetin
3.2.3. Ảnh hưởng của nuụi cấy lỏng lắc ủến nhõn sinh khối callus của hai giống cõy ăn quả cú mỳ
giống cõy ăn quả cú mỳi
Nuụi cấy lỏng lắc là một phương phỏp quan trọng, ủược sử dụng phổ
biến ở nhiều loài thực vật ủể nõng cao hiệu suất nhõn sinh khối callus. Theo
Pierik (1987), nuụi cấy callus trong mụi trường lỏng cú nhiều ưu ủiểm hơn so
0 1 2 3
0 0.5 1 2
Cam sành Cam Valencia
hệ s ố n h ân s in h k h ố i (l ần )
Hỡnh 3.7. Ảnh hưởng của ME ủến nhõn sinh khối ở hai giống cam Sành và cam Valencia
Hỡnh 3.8. Sinh khối của callus trờn mụi trường bổ sung 0,5mg/l ME
1. Sinh khối callus cam Sành 2. Sinh khối callus cam Valencia
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 64
với mụi trường ủặc, như diện tớch tiếp xỳc bề mặt giữa callus và mụi trường dinh dưỡng tăng lờn, lượng oxi cung cấp cũng cao hơn, do ủú callus khụng bị
ức chế sinh trưởng, phỏt triển như trong mụi trường ủặc. Vỡ vậy chỳng tụi ủó
tiến hành thớ nghiệm này nhằm so sỏnh với phương phỏp nhõn sinh khối callus trờn mụi trường ủặc.
Sinh khối callus của hai giống cú trọng lượng ban ủầu 0,5 gram ủược ủưa vào bỡnh Ehlenmeyer 250 ml với cỏc thể tớch mụi trường lỏng khỏc nhau:
10- 20- 30 - 40 - 60 ml, nuụi cấy lắc với tốc ủộ 10 - 30 - 60 - 80 vũng/ phỳt trong ủiều kiện tối hoàn toàn. Mỗi cụng thức 5 bỡnh, lặp lại 3 lần, kết quả thớ nghiệm ghi lại sau 2 tuần nuụi cấy.
Mụi trường nuụi cấy ủó ủược sử dụng ở những thớ nghiệm trờn:
MT1: MT + BAP 0,5 mg/l + 30g ủường Sucrose + 0,5 g/l ME + 6g/l Agar MT2: MT + BAP 1mg/l + 30g ủường Sucrose + 0,5 g/l ME + 6g/l Agar MT3: MT + BAP 2mg/l + 30g ủường Sucrose + 0,5 g/l ME + 6g/l Agar Cỏc callus này ủược ủưa trở lại mụi trường ủặc thớch hợp ủể lưu giữ cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2.3.1. Ảnh hưởng của thể tớch mụi trường ủến nhõn sinh khối callus
Sau 4 tuần nuụi cấy chỳng tụi thu ủược cỏc kết quả như sau:
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thể tớch mụi trường khỏc nhau ủến nhõn sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia
Cam Sành Cam Valencia Thể tớch mụi trường (ml) MT1 MT2 MT3 MT1 MT2 MT3 10 1,29ab 1,13a 0,56bc 1,41b 1,76b 1,12bc 20 2,19bc 1,97c 1,36a 2,48bc 2,11a 1,93c 30 3,30a 2,55ab 1,95b 3,68a 3,37bc 2,34b 40 2,02b 1,55bc 1,23c 2,39ab 1,99c 1,69a 60 1,56c 1,21b 0,96a 1,66c 1,51a 1,11b
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 65
Kết quả thu ủược cho thấy mụi trường lỏng lắc ảnh hưởng rất nhiều ủến hệ số nhõn sinh khối callus của hai giống cam Sành và cam Valencia. Với trọng lượng mẫu ban ủầu là 0,5 gram, sau 4 tuần nuụi cấy sinh khối callus ủó tăng lờn ủỏng kể. Sinh khối callus tăng lờn khi thể tớch mụi trường tăng lờn từ 10 ml - 60 ml, tăng mạnh nhất khi thể tớch mụi trường là 30ml trờn MT1, ủối với cam Sành là 3,30 lần, và với cam Valencia là 3,68 lần. Nếu thể tớch mụi trường tăng quỏ cao thỡ sinh khụi callus khụng những khụng tăng mà cũn hoỏ
Hình 3.10. Sinh trưởng của callus cam Sành trờn môi tr−ờng lỏng lắc
1. Callus trắng với thể tích mơi tr−ờng 30 ml 2. Callus hố nâu với thể tích mơi tr−ờng 60ml
1 2
Hình 3.9. ảnh h−ởng của thể tích mơi tr−ờng đến nhân sinh khối callus của hai giống cam Sành và cam Valencia
0 1 2 3 4 MT1 MT2 MT3 MT1 MT2 MT3
Cam Sành Cam Valencia
Thể tớch mụi trường 10 (ml) Thể tớch mụi trường 20 (ml) Thể tớch mụi trường 30 (ml) Thể tớch mụi trường 40 (ml) Thể tớch mụi trường 60 (ml) T ỷ l ệ n hõ n ca ll us ( l ầ n)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 66
nõu rồi chết, ủặc biệt callus bị chết khỏ nhiều khi nuụi cấy trong mụi trường cú thể tớch 60 ml ở cả hai giống.
Theo dừi thớ nghiệm chỳng tụi quan sỏt thấy với dung tớch 10 - 30 ml, cỏc cụm callus này sinh trưởng và phỏt triển bỡnh thường; ngược lại khi ở
dung tớch 30 - 60 ml sinh trưởng của callus bị ức chế, thậm chớ callus chết với tỷ lệ cao, hoặc cú thể trở nờn mọng nước. Chứng tỏ mật ủộ callus trong mụi trường ảnh hưởng rất lớn ủến khả năng sinh trưởng của chỳng. Bờn cạnh ủú,
nhu cầu về CðHST của callus trong mụi trường lỏng lắc cũng giảm so với trong mụi trường ủặc, sinh khối callus ủạt cao nhất trong mụi trường cú BAP 0,5 và 1 mg/l. Cú thể do, trong mụi trường lỏng, callus dễ dàng thu nhận cỏc chất cần thiết cho mọi hoạt ủộng sống của callus hơn trong mụi trường ủặc.
Túm lại, thể tớch mụi trường 30 ml trong nuụi cấy lỏng lắc thớch hợp cho nhõn sinh khối callus của hai giống cam Sành và cam Valencia.
3.2.3.1. Ảnh hưởng của tốc ủộ lắc ủến nhõn sinh khối callus
Sau khi thu ủược kết quả như trờn chỳng tụi tiếp tục tiến hành thớ
nghiệm với tốc ủộ lắc khỏc nhau ủến nhấn sinh khối callus. Kết quả sau 4 tuần nuụi cấy chỳng tụi thu ủược kết quả trờn bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tốc ủộ lắc khỏc nhau ủến nhõn sinh khối callus ở cam Sành và cam Valencia
Cam Sành Cam Valencia Tốc ủộ lắc (vũng/phỳt) MT1 MT2 MT3 MT1 MT2 MT3 10 2,17bc 1,59c 1,28b 2,01a 2,21bc 1,53ab 30 3,30a 2,55ab 1,95b 3,37bc 3,68a 2,34b 60 4,65b 4,15c 3,24bc 4,32ab 4,87c 3,38a 80 3,54c 3,41a 2,02c 3,46b 3,66b 2,33c
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 67
Theo như kết quả ở bảng 3.8 và hỡnh 3.11 thỡ nếu tốc ủộ lắc quỏ thấp
hay quỏ cao ủều ảnh hưởng tới nhõn sinh khối callus. Nếu tốc ủộ lắc quỏ thấp 10 vũng/phỳt thỡ sinh trưởng của callus rất chậm, ủiều này cú thể do tốc ủộ lắc quỏ thấp làm mụi trường khụng ủủ thoỏng khớ, callus bị ngập trong mụi
trường làm ức chế sự sinh trưởng và phỏt triển của callus. Nhưng nếu tốc ủộ
lắc quỏ cao cũng làm chết và mất khả năng tỏi sinh của nguồn mụ sẹo phụi hoỏ, do khi lắc với tốc ủộ lớn làm tăng va chạm của cỏc callus với nhau, gõy ra những tổn thương trờn bề mặt callus, làm chỳng sinh trưởng kộm ủi. Với
tốc ủộ lắc 60 vũng/phỳt sinh khối callus tăng cao nhất với 4,65 lần ủối với
cam Sành trờn mụi trường MT1 và 4,87 lần với cam Valencia trờn mụi trường MT2, và cỏc callus thu ủược trờn mụi trường này phần lớn trắng xốp, rời rạc, và tốc ủộ tỏi sinh rất nhanh khi chuyển sang mụi trường ủặc.
Cần phải luõn chuyển những callus này giữa lỏng và ủặc, chỳng sẽ sinh trưởng và phỏt triển nhanh hơn, thậm chớ những callus ủó bị hoỏ nõu khi
chuyển sang mụi trường ủặc vẫn cú khả năng tỏi sinh, và dần chuyển sang Hình 3.11. ảnh h−ởng của tốc độ lắc và thể tích mơi tr−ờng khác nhau đến
nhân sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia
0 1 2 3 4 5 6 Thể tớch 10 (ml) Thể tớch 20 (ml) Thể tớch 30 (ml) Thể tớch 60 (ml) Tốc ủộ 30 (vũng/phỳt) Tốc ủộ 60 (vũng/phỳt) Tốc ủộ 80 (vũng/phỳt)
Cam Sành trờn MT1 Cam Sành trờn MT2 Cam Sành trờn MT3 Cam Valencia trờn MT1 Cam Valencia trờn MT2 Cam Valencia trờn MT3
T ỷ l ệ n h õ n c a llu s ( l ầ n )
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 68
màu trắng như ban ủầu. Nuụi cấy lỏng lắc làm callus trở nờn mềm hơn, sự
liờn kết tế bào kộm chặt chẽ hơn, ủõy cú thể là nguyờn nhõn chớnh khiến
chỳng phõn chia mạnh hơn khi chuyển lờn mụi trường ủặc. Vỡ với kết cấu
lỏng lẻo như vậy, sự tiếp xỳc tế bào và tế bào trong cỏc cụm callus giảm ủi, trong khi tương tỏc giữa tế bào và mụi trường tăng lờn, tế bào dễ dàng thu nhận dinh dưỡng, CðHST cần thiết cho sinh trưởng, phỏt triển của nú [52].
Như võy, nhõn sinh khối callus ở hai giống cam bằng phương phỏp
nuụi cấy lỏng lắc là rất cần thiết, với tốc ủộ và thể tớch thớch hợp là 60
vũng/phỳt và 30ml mụi trường nuụi cấy.