- Xỏc ủịnh sự tăng sinh khối callus trong mụi trường lỏng lắc bằng cỏch cõn trọng lượng callus trước và sau khi nuụi cấy, từ ủú tớnh hệ số tăng sinh
2. Callus Valencia cứng trờn mụi trường cú bổ sung 2mg/l 2,4D và 2mg/l Kinetin
3.3. Tỏch và nuụi cấy tế bào trần từ mụ sẹo phụi hoỏ
Mụ sẹo phụi hoỏ là nguồn mẫu vật hữu hiệu nhất cho nuụi cấy tế bào trần do khả năng tỏi sinh rất cao của nú. Chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm tỏch tế bào trần ở giai ủoạn mẫu ủang sinh trưởng mạnh nhất (ở giai ủoạn 2-3 tuần tuổi ủối với mẫu mụ sẹo phụi hoỏ nuụi cấy trờn mụi trường ủặc và 7-11 ngày
ủối với mẫu nuụi cấy mụ sẹo phụi hoỏ lỏng lắc). Cỏc bước tỏch tế bào trần từ
mụ sẹo phụi hoỏ ủược thực hiện như sau:
- Lấy 100-200mg mụ sẹo phụi hoỏ (giai ủoạn 2-3 tuần tuổi trong chu kỳ
nuụi cấy 4 tuần ở mụi trường ủặc) và 1-2ml dung dịch nuụi cấy huyền phự (giai ủoạn 7-11 ngày trong chu kỳ nuụi cấy 14 ngày) cho vào ủĩa petri
60x15mm;
- Bổ sung 2,5ml mụi trường BH3 0,7M lỏng vào ủĩa petri với mẫu nuụi cấy
ở mụi trường ủặc;
- Bổ sung 1,5ml enzym từng giọt từng giọt vào ủĩa petry bằng pipet ủể cho
cỏc tế bào dễ dàng tỏch nhau ra;
- Bọc kớn ủĩa petry bằng parafilm và giữ trong ủiều kiện lắc nhẹ 50
vũng/phỳt với thời gian từ 6-16 giờ;
- Cỏc tế bào trần sau khi tỏch sẽ ủược lọc qua màng lọc 45àm ủể loại bỏ cỏc mảnh vỡ của mụ tế bào;
- Sau khi lọc tế bào trần ủược làm sạch bằng cỏch: chuyển dung dịch tế bào trần ủó lọc sang ống ly tõm dung tớch 15ml và bổ sung 5ml dung dịch
sucrose 25% sau ủú bổ sung từ từ 2ml dung dịch manitol 13% (trỏnh ủể 2 lớp dung dịch này trộn lẫn vào nhau), ly tõm hỗn hợp dung dịch này ở tốc
ủộ 100g (tương ủương 750 vũng/phỳt) trong 4 phỳt;
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 71
Sau khi tỏch ủược tế bào trần ở cả hai giống cam Sành và cam
Valencia, chỳng tụi tiếp tục tiến hành cỏc thớ nghiệm ủể tỏi sinh ủược cõy từ nguồn tế bào trần này. Cỏc giống cõy ăn quả cú mỳi khỏc nhau cú khả năng
tỏi sinh cõy rất khỏc nhau từ TBT. Nhỡn chung mụ sẹo phụi hoỏ cú nguồn gốc từ nuụi cấy mụ noón, dịch lỏng tế bào từ mụ sẹo phụi hoỏ là nguồn cung cấp tế bào trần cú khả năng tỏi sinh cao nhất.
Trong cỏc thớ nghiệm tỏi sinh TBT chỳng tụi sử dụng cỏc loại ủường
khỏc nhau và ủiều kiện nuụi cấy khỏc nhau ủể so sỏnh và ủỏnh giỏ. Cỏc loại
ủường này khụng chỉ nguồn carbon, mà cũn là chất tạo ỏp suất thẩm thấu ủược sử dụng trong cỏc mụi trường nuụi cấy khỏc nhau và cú ảnh hưởng
quyết ủịnh ủối với tỏch nuụi tế bào trần và tỏi sinh cõy. Nhiều nghiờn cứu
khỏc nhau ủó khẳng ủịnh hiệu qủa của nguồn carbon/chất thẩm thấu, mật ủộ
tế bào nuụi cấy (số tế bào/1 ml mụi trường) ủối với tỏi sinh cõy. Mụi trường
nuụi cấy tế bào trần thành cụng nhất cú sử dụng kết hợp cả sucrose và manitol. Mụi trường BH3 ủược sử dụng ủể rửa tất cả cỏc loại tế bào trần và
nuụi cấy những kiểu gen khú tỏi sinh. Tế bào trần chỳng tụi sử dụng ủể nuụi cấy với nồng ủộ xấp xỉ 1 x 105 tế bào/1ml mụi trường nuụi cấy. Mật ủộ tế bào
ủược xỏc ủịnh hoặc ủiều chỉnh ủược thụng qua việc sử dụng một hồng cầu kế
Hinh 3.13. Hỡnh ảnh tế bào trần
1. Tế bào trần tỏch từ mụ sẹo phụi hoỏ 2. Tế bào trần trờn mụi trường tỏi sinh BH3
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 72
tiờu chuẩn. Chỳng tụi tiến hành nuụi tế bào trần trong mụi trường lỏng, và mụi trường ủặc (trong một lớp mỏng dung dịch hoặc một hố nụng ỏ trong ủỉa Petri 60mm x 15mm. Agarose cú ủiểm tan thấp cú thể ủược sử dụng trong
nuụi cấy tế bào trần trờn mụi trường ủặc). Nuụi cấy tế bào trần lớp mỏng cú thể ủựơc chuẩn bị bằng cỏch lắc nhẹ 1,5ml dung dịch tế bào trần huyền phự ủến khi loại bỏ ủược sức căng bề mặt của bề mặt nhựa. Nuụi cấy hố nụng cú
thể ủược chuẩn bị bằng cỏch trải 4-8 giọt tế bào trần huyền phự vào trung tõm của ủĩa Petri nhựa 60mm x 15mm, sau ủú thờm vài giọt mụi trường nuụi cấy vũng quanh ủĩa ủể duy trỡ ủộ ẩm. Sau khi cấy ủĩa Petri ủược bọc kớn bằng
Nescofilm và cất giữ trong hộp nhựa ủể trong tối ở 28oC từ 4-6 tuần. Sự phõn chia tế bào ủầu tiờn quan sỏt ủược sau 10-14 ngày nuụi cấy.
Sau 4-6 tuần nuụi cấy chỳng tụi bổ sung mụi trường ủể làm giảm nồng
ủộ cỏc chất thẩm thấu bằng cỏch nhỏ thờm 10-12 giọt hỗn hợp mụi trường cú
tỷ lệ (thể tớch) 1:2 BH3 và MT (Murashige và Tucker 1969) chứa 125 g/l sucrose và 0,5g/l malt extract. Sau ủú nuụi tiếp từ 2-4 tuần dưới cường ủộ ỏnh sỏng thấp. ðể giảm thấp hơn nữa chất thẩm thấu cho thờm 10-12 giọt hỗn hợp cú tỷ lệ 1:2 BH3 và dung dịch mụi trường EME (MT cơ bản chứa 50g/l sucrose và 0,5g/l malt extract). Tại thời ủiểm này, tế bào nuụi cấy khoẻ nhất cú thể ủược chuyển vào ủĩa Petri lớn hơn 100mm x 15mm chứa mụi trường
agar ủặc EME. Tế bào nuụi cấy như vậy ủược giữ ẩm bằng hỗn hợp dung dịch
ủó ủề cập ở trờn cho ủến khi cỏc cụm mụ sẹo thớch hợp với mụi trường cứng.
Sau mỗi 2 tuần lại bổ sung 10-12 giọt dung dịch mụi trường EME cho tất cả cỏc nuụi cấy lỏng. Khi cỏc cụm mụ sẹo phụi hoỏ tỏi sinh từ TBT ủạt ủến kớch thước 1-2mm thỡ cần ủược cấy chuyến sang mụi trường agar ủặc EME. Thụng thường sau 6-16 tuần kể từ khi bắt ủầu nuụi cấy tế bào trần, cỏc phụi soma ủược hỡnh thành.
Như vậy việc tỏch và nuụi tế bào trần ủó thu ủược kết quả, và nguồn
callus ủó ủược tỏi sinh này ủược chỳng tụi nhõn lờn theo quy trỡnh ở trờn ủể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 73
3.4. Nghiờn cứu tỏi sinh cõy từ tế bào trần cú nguồn gốc mụ sẹo phụi hoỏ