Cam Sành Cam Valencia Tốc ủộ lắc (vũng/phỳt) MT1 MT2 MT3 MT1 MT2 MT3 10 30 60 80
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 47
2.3.2.4. Nhõn sinh khối thụng qua hệ thống Bioreactor
Mẫu mụ sẹo phụi hoỏ ở trờn ủược sử dụng trong thớ nghiệm này, sử
dụng lượng mẫu cú tỷ lệ tương ứng với nuụi cấy lỏng lắc ở quy mụ nhỏ. Sau
ủú tiến hành so sỏnh với nhõn sinh khối callus ở quy mụ lớn bằng hệ thống
Bioreactor. Thớ nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần.
2.3.3. Phương phỏp tỏch và tỏi sinh tế bào trần từ mụ sẹo phụi hoỏ
2.3.3.1.Cỏc hoỏ chất ủược sử dụng ủể tỏch tế bào trần
1. CaCl2.2H2O: 0,024 M 2. MES (2(N-morpholino) ethanol sulfonic acid): 6,15 mM 3. NaH2PO4.H2O: 0,92 M 4. Manitol: 0,7 M 5. Enzym Cellulase: 1% 6. Enzym Macerase: 1% 7. Enzym Pectolyase Y23: 0,2%
2.3.3.2. Chuẩn bị dung dịch enzym
- Lấy lượng nước cất bằng khoảng 2/3 thể tớch dung dịch cần pha;
- Hoà tan hoàn toàn cỏc chất theo thứ tự từ 1 – 4 ở trờn, sau ủú ủổ cỏc
enzym vào và lắc rất chậm trỏnh làm xuất hiện bọt khớ;
- Sau khi cỏc enzym ủó tan hồn tồn chỉnh dung dịch ủến thể tớch cần pha và chỉnh pH của dung dịch lờn khoảng 5,6-5,7;
- Khử trựng dung dịch enzym bằng màng lọc 0,22 àm; - Bảo quản enzym ở nhiệt ủộ < 0oC.
Mụ sẹo phụi hoỏ là nguồn mẫu vật hữu hiệu nhất cho nuụi cấy tế bào trần do khả năng tỏi sinh rất cao của nú. Thớ nghiệm tỏch tế bào trần ủược tiến hành ở giai ủoạn mẫu ủang sinh trưởng mạnh nhất thụng thường ở giai ủoạn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp…………… 48
2-3 tuần tuổi ủối với mẫu mụ sẹo phụi hoỏ nuụi cấy trờn mụi trường ủặc và 7- 11 ngày ủối với mẫu nuụi cấy mụ sẹo phụi hoỏ lỏng lắc.
2.3.3.3. Cỏc bước tỏch tế bào trần từ mụ sẹo phụi hoỏ
+ Mụ sẹo phụi hoỏ ủược cấy chuyển thường xuyờn sang mụi trường mới nhằm duy trỡ và nhõn mụ sẹo phụi hoỏ. Mụi trường duy trỡ mụ sẹo khụng cú chất ủiều hoà sinh trưởng [29] hoặc cú chứa BA cao [50]. Sử dụng mụi trường
ủặc EME hoặc H+H với chu kỳ cấy chuyển 2 tuần một lần.
+ Cú thể tỏch ủược tế bào trần bằng cỏch thấm ướt cơ học, lấy khoảng 1 g (trọng lượng tươi) callus xốp (2-3 tuần tuổi trong chu kỳ cấy chuyển 4 tuần) cho vào 3ml 0.7 M BH3 trong ủĩa Petri loại 60 x 15mm, tiếp theo nhỏ từng giọt từng giọt 1ml dung dịch enzyme. Bọc ủĩa Petri bằng Nescofilm và nuụi ở
ủiều kiện mỏy lắc trũn 50 vũng/phỳt, 4-16 giờ trong tối.
+ Lọc tế bào trần như ủó miờu tả rừ. Sử dụng gradient nồng ủộ giữa
sucrose - manitol ủó ủược chỉ dẫn ủể tinh sạch tế bào trần từ callus ở tất cả
cỏc nguồn gốc.
+ Làm sạch tế bào trần sau khi ủược lọc
+ Tỏch lớp tế bào nằm giữa hai lớp dung dịch ta thu ủược cỏc tế bào trần.
2.3.4. Nghiờn cứu tỏi sinh cõy từ tế bào trần cú nguồn gốc mụ sẹo phụi hoỏ ở hai giống citrus hoỏ ở hai giống citrus
2.3.4.1. Tạo phụi vụ tớnh tế bào trần của hai giống citrus