3. í nghĩa của đề tài
2.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
Lợn Mẹo nuụi tại huyện Pỏc Nặm tỉnh Bắc Kạn 2.2. Địa điểm - thời gian tiến hành
- Địa điểm: huyện Pỏc Nặm tỉnh Bắc Kạn
- Phõn tớch mẫu tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thỏi Nguyờn Viện Cụng nghệ sinh học Việt Nam
- Phối kết hợp: phũng Nụng nghiệp huyện Pỏc Nặm tỉnh Bắc Kạn - Thời gian tiến hành: từ thỏng 07/2010 đến thỏng 07/2011.
2.3. Nội dung nghiờn cứu
2.3.1. Nghiờn cứu khả năng sinh trưởng qua cỏc thỏng tuổi của lợn thịt
- Sinh trƣởng tớch luỹ (kg/con) - Sinh trƣởng tƣơng đối (%) - Sinh trƣởng tuyệt đối
2.3.2. Nghiờn cứu chất lượng thịt lợn Mẹo
- Mổ khảo sỏt: dài thõn thịt, độ dày mỡ lƣng, diện tớch cơ thăn, tỷ lệ múc hàm, tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ thịt nạc, tỷ lệ mỡ, …
- Phõn tớch thành phần hoỏ học thịt lợn Mẹo: Vật chất khụ, Protein thụ, lipid thụ, khoỏng tổng số.
- Phõn tớch thành phần acid amine
2.3.3. Phõn tớch đa hỡnh gen liờn quan đến chất lượng thịt lợn Mẹo
- Phõn tớch đa hỡnh gen H-FABP ở lợn Mẹo bằng phƣơng phỏp PCR-RFLP.
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
- Tiến hành thớ nghiệm tại 3 xó của huyện, mỗi xó theo dừi 3 đàn lợn, kỹ thuật chăm súc nuụi dƣỡng của cỏc đàn lợn thớ nghiệm là nhƣ nhau.
2.4.1. Phương phỏp nghiờn cứu khả năng sinh trưởng của đàn lợn Mẹo
2.4.1.1. Sinh trưởng tớch luỹ
+ Sinh trưởng tớch luỹ: là khối lƣợng, kớch thƣớc, thế tớch của vật nuụi
tớch luỹ đƣợc qua thời gian khảo sỏt. Cỏc thụng số thu đƣợc qua cỏc lần cõn đo là biểu thị sinh trƣởng tớch luỹ của vật nuụi.
Cõn khối lƣợng lợn tại thời điểm kiểm tra (Sơ sinh, 30 ngày; cỏc giai đoạn nuụi thịt: 3, 4, 5....12 thỏng tuổi). Cõn cựng một chiếc cõn và một ngƣời cõn, cõn vào buổi sỏng, trƣớc lỳc cho ăn.
2.4.1.2. Sinh trưởng tương đối
+ Sinh trưởng tương đối (R): là tỷ lệ% của phần khối lƣợng (thể tớch,
kớch thƣớc) tăng lờn so với khối lƣợng (thể tớch, kớch thƣớc) thời điểm cõn đo. Đơn vị sinh trƣởng tƣơng đối thƣờng là%.
+ Sinh trƣởng tƣơng đối (%) đƣợc xỏc định theo cụng thức: W1- W0
R(%) = x 100 W1 + W0
2
2.4.1.3. Sinh trưởng tuyệt đối
+ Sinh trưởng tuyệt đối(G): Là trọng lƣợng, kớch thƣớc của cơ thể gia
sỳc tăng lờn trong một đơn vị thời gian. Đối với lợn, đơn vị thời gian thƣờng là ngày.
+ Sinh trƣởng tuyệt đối (g/ngày) đƣợc xỏc định theo cụng thức: W1- W0
G = t1 - t0
2.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu chất lượng thịt lợn Mẹo
2.4.2.1. Mổ khảo sỏt
* Thời gian mổ khảo sỏt: Lợn Mẹo đạt 12 thỏng tuổi (thời điểm kết
thỳc thớ nghiệm).
* Phƣơng phỏp mổ khảo sỏt
Để lợn nhịn ăn 24 giờ, cõn khối lƣợng hơi. Chọc tiết và xỏc định khối lƣợng tiết, cạo lụng bằng nƣớc sụi 800C. Mổ lấy nội tạng và tiến hành xỏc định cỏc chỉ tiờu nhƣ: khối lƣợng múc hàm, khối lƣợng nội tạng, khối lƣợng thịt xẻ, khối lƣợng thịt nạc, xƣơng, thịt mỡ.
+ Chỉ tiờu khảo sỏt chất lượng thịt:
Khối lƣợng hơi (kg/con)
KL múc hàm (kg/con) = KL hơi - (KL tiết + lụng) - KL nội tạng
Khối lƣợng thịt xẻ đƣợc tớnh bằng:
Khối lƣợng thịt xẻ = Khối lƣợng múc hàm - (KL đầu + KL 4 chõn).
Khối lƣợng thịt nạc, mỡ, xƣơng, da Tỷ lệ cỏc phần thịt: Tỷ lệ thịt xẻ (%) = Khối lƣợng thịt xẻ x 100 Khối lƣợng hơi (sống) Tỷ lệ thịt nạc (%) = Khối lƣợng thịt nạc x 100 Khối lƣợng thịt xẻ Tỷ lệ thịt mỡ (%) = Khối lƣợng thịt mỡ x 100 Khối lƣợng thịt xẻ
Tỷ lệ thịt xƣơng (%) = Khối lƣợng thịt xƣơng x 100 Khối lƣợng thịt xẻ
2.4.2.2. Phương phỏp phõn tớch mẫu thịt
- Phõn tớch hàm lƣợng Protein theo phƣơng phỏp Kjeldandl trờn mỏy Gerhard theo TCVN 4328-2001 (ISO 5983: 1997)
- Phƣơng phỏp phõn tớch acid amine xỏc định trờn thiết bị HPLC
- Phõn tớch hàm lƣợng lipid trờn mỏy Soclex theo TCVN 4331-2001 (ISO 6492:1999)
- Phõn tớch khoỏng tổng số theo TCVN 4327 - 1:2007 (ISO 5984-2002)
2.4.3. Phõn tớch đa hỡnh gen
2.4.3.1. Nguyờn liệu phõn tớch gen
Mẫu mụ tai của giống lợn Mẹo đƣợc nuụi trờn địa bàn huyện Pỏc Nặm tỉnh Bắc Kạn (n = 80 ).
Mẫu mụ tai đƣợc bảo quản trong cồn 750, ở - 200C, đƣợc sử dụng phõn tớch cỏc gen trong nghiờn cứu.
* Hoỏ chất
Cặp mồi trong nghiờn cứu cú trỡnh tự nhƣ sau: Mồi xuụi (F): ATTGCCTTCGGTGTGTTTGAG Mồi ngƣợc (R): TCAGGAATGGGAGTTATTGG
* Cỏc dung dịch và đệm pha chế sử dụng trong nghiờn cứu Bảng 2.1. Đệm và cỏc dung dịch pha chế
Dung dịch Thành phần
Đệm phỏ màng tế bào (Lysis buffer)
100mM Tris-HCl; 100mM EDTA; 0,1 M NaCl; 2,1%SDS; pH 8,0
Dung dịch kết tủa protein Amonium Acetate (NH4CH3COO) 7,5M
Đệm TE 100mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0
Đệm TBE 10x 1M Tris-HCl;830mM acid boric; 1mM EDTA; pH 8,0
2.4.3.2. Phương phỏp tỏch chiết DNA từ mẫu mụ tai lợn
Hỡnh 2.1: Sơ đồ quy trỡnh thớ nghiệm
Nguyờn tắc
Phƣơng phỏp tỏch chiết DNA dựa trờn cỏc tớnh chất lý hoỏ học đặc trƣng của DNA và sự khỏc biệt so với cỏc hợp chất hữu cơ khỏc nhƣ protein, lipid, RNA... trong tế bào để loại bỏ cỏc tạp chất ra khỏi mẫu bằng cỏc hoỏ chất, cỏc đặc điểm vật lý khỏc nhau.
Xỏc định kiểu gen của H-FABP
Khuyếch đại gen H-FABP bằng phƣơng phỏp PCR với cặp mồi đặc hiệu
Thu mẫu mụ tai (n = 80)
Tỏch chiết và tinh sạch DNA hệ gen từ mẫu mụ tai lợn
Xỏc định nồng độ và tinh sạch DNA bằng quang phổ kế, điện di trờn Gel agarose 1%
Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn đoạn gen H- FABP với HaeIII
Tiến hành
Bƣớc 1: Phỏ vỡ màng tế bào và nhõn
Sử dụng khoảng 20mg/mẫu mụ tai lợn (đƣợc lấy ra từ ống bảo quản bằng cồn 700
, trong -200C), để khụ cồn trong khụng khớ ở nhiệt độ phũng. Nghiền mẫu thành dạng bột mịn trong nitơ lỏng, đảm bảo cho cỏc tế bào tỏch rời nhau tạo điều kiện hoạt động cho cỏc hoỏ chất, đồng thời nhờ hoạt động cơ học phỏ vỡ màng tế bào.
Bổ sung 500àl đệm phỏ tế bào cú tỏc dụng phỏ vỡ màng tế bào và màng nhõn, giải phúng DNA ra ngoài mụi trƣờng. Trong thành phần của đệm phỏ màng cú chứa SDS và EDTA khụng chỉ giỳp phỏ màng tế bào mà cũn cú khả năng ức chế hoạt động của nuclease, đảm bảo cho DNA khụng bị phõn huỷ trong quỏ trỡnh tỏch chiết.
Bƣớc 2: Loại bỏ cỏc thành phần khụng cú bản chất DNA
Thờm 2,5àl protease K (20mg/ml) sau đú ủ trong thời gian từ 8-10 tiếng ở 560C. Sử dụng protease K để cắt protein nằm trong nội bào hay liờn kết với DNA.
Bổ sung 2àl RNase (100mg/ml) trong thời gian 1 tiếng ở 370
C, RNase để cắt cỏc RNA.
Bổ sung 500àl CH3COONH4 7,5M trong thời gian 2 tiếng ở -200C, cỏc muối amoni cú tỏc dụng kết tủa cỏc protein và cỏc thành phần khỏc trong dung dịch. Ly tõm 13.000 rpm/phỳt, trong 30 phỳt ở 40C, để lắng cỏc phần kết tủa xuống dƣới đỏy. Thu dung dịch nổi và loại bỏ cạn. (Thực hiện 2 lần).
Bƣớc 3: Tủa DNA
Bổ sung ethanol tuyệt đối vào tủa DNA theo tỷ lệ 2:1 để trong thời gian 2 tiếng ở -200C. Sau đú ly tõm với tốc độ 13.000 rpm/phỳt trong 30 phỳt ở 40C. Thu tủa.
Rửa tủa bằng 500 àl ethanol 700, ly tõm với tốc độ 13.000 rpm/phỳt, trong 30 phỳt ở 40C, thu tủa. Để khụ cồn trong khụng khớ ở nhiệt độ phũng. (Thực hiện 2 lần). Hoà tan tủa bằng 100àl TE và bảo quản ở 40
C.
2.4.3.3. Phương phỏp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose
DNA sau khi đƣợc tỏch chiết, sản phẩm phản ứng PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng phỏp chạy điện di.
Nguyờn tắc
Ở pH trung tớnh, DNA tớch điện õm nhờ cỏc nhúm phosphate nằm trờn khung phosphodieste của cỏc acid nucleic, nờn khi chạy trong điện trƣờng cú điện thế và cƣờng độ thớch hợp, chỳng sẽ chuyển từ cực õm sang cực dƣơng của điện trƣờng. Khi chạy điện di trờn giỏ thể là gel agarose tuỳ thuộc vào kớch thƣớc và độ dài đoạn DNA mà chỳng sẽ phõn tỏch thành cỏc băng khỏc nhau trờn bản gel điện di. Phõn tử cú kớch thƣớc lớn sẽ dịch chuyển chậm hơn phõn tử cú kớch thƣớc nhỏ.
Loại gel phổ biến nhất là agarose, agarose đƣợc chiết suất từ tảo biển, nú bị núng chảy trong dung dịch đệm ở nồng độ thớch hợp, thƣờng khoảng 0,3-2,0% (w/v), khi làm nguội, agarose đụng lại thành gel, đƣợc dựng làm khuụn tra mẫu trong điện di.
Nồng độ gel phụ thuộc vào kớch thƣớc trung bỡnh của cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch. Đoạn DNA cú kớch thƣớc càng nhỏ đũi hỏi hàm lƣợng agarose trong gel càng lớn và ngƣợc lại. Bảng 2.2 dƣới đõy cho thấy mối tƣơng quan giữa nồng độ agarose và độ lớn của cỏc phõn tử DNA cần phõn tớch.
Bảng 2.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gel agarose và kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tớch theo Sambrook và cs (1998)[60] Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tớch (kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 Tiến hành
Chuẩn bị agarose với nồng độ thớch hợp để kiểm tra cỏc sản phẩm. Agarose đƣợc hoà tan trong đệm TBE 1x, đun cho tan chảy trong lũ vi súng. Để nguội trong khoảng 40-500C, rút gel vào khay điện di đó cài sẵn lƣợc, độ dày gel 3-5mm, để khoảng 30 phỳt cho gel đụng lại, rỳt lƣợc ra. Đặt gel vào buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1x ngập mặt bản gel 0,5-1cm.
Lấy 10àl DNA trộn với 2àl Loading dye (cú chức năng kộo mẫu xuống đỏy giếng và chặn khụng cho mẫu chạy khỏi bản điện di). Sau đú tra mẫu vào cỏc giếng cựng với chỉ thị DNA (100bp) để ƣớc lƣợng kớch thƣớc phõn tử DNA và chạy điện di với hiệu điện thế là 100V.
Khi kết thỳc điện di, bản gel sẽ đƣợc nhuộm bằng Ethedium bromide 1% (EtBr cú khả năng liờn kết với cỏc base của nucleotide và phỏt huỳnh quang dƣới tỏc dụng của tia tử ngoại) Khoảng 15-20phỳt, rửa nhẹ bằng nƣớc cất, cỏc băng DNA sẽ đƣợc quan sỏt và chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng của tia tử ngoại (254nm). Quan sỏt và chụp ảnh gel bằng hệ thống chụp ảnh tự động.
2.4.3.4. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
Nguyờn tắc:
Dựa trờn sự hấp thụ ỏnh sỏng tia tử ngoại ở bƣớc súng 260nm của cỏc base purine và pirimidine mà ngƣời ta cú thể định lƣợng DNA trong dung dịch.
Giỏ trị mật độ quang ở bƣớc súng 260nm (OD260: Optical Density) của cỏc mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lƣợng DNA cú mặt trong dung dịch, cho phộp xỏc định nồng độ DNA trong mẫu.
Nồng độ của DNA đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
CDNA(àg/ml) = OD260 x 50(àg/ml) x Độ pha loóng.
Trong đú: 1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA = 50(àg/ml)
Độ pha loóng là độ pha loóng mẫu trong quỏ trỡnh đo.
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, ngƣời ta đo thờm giỏ trị OD ở bƣớc súng 280nm (OD280). 280nm là bƣớc súng ở đú cỏc protein cú mức hấp thụ cao nhất nhƣng cỏc protein cũng hấp thụ ỏnh sỏng ở bƣớc súng 260nm nhƣ cỏc acid nucleic và do đú làm sai lệch giỏ trị thật của nồng độ của acid nucleic.
Độ tinh sạch của DNA đƣợc tớnh bằng tỷ số bƣớc súng 260nm/280nm. Một dung dịch nucleic đƣợc xem là sạch, khụng tạp nhiễm RNA và protein khi tỷ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [3].
Tiến hành
Đối chứng 1ml TE 1x
Mẫu 5àl mẫu DNA + 495 àl TE 1x
- Cuvette đối chứng: Lấy 1 ml TE 1x cho vào 1 cuvette để làm đối chứng. - Cuvette đo mẫu:
+ Lấy 5 àl dung dịch DNA (50àg/ml) cần định lƣợng hoà tan trong 495àl TE 1x (pha loóng 100 lần). Sau đú đo OD ở bƣớc súng 260nm và 280nm.
Từ cỏc giỏ trị OD thu đƣợc ở 2 bƣớc súng, cú thể tớnh nồng độ và độ tinh sạch của DNA theo cụng thức trờn.
2.4.3.5. Phản ứng PCR
Nguyờn tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để
tổng hợp cỏc đoạn DNA mới từ mạch khuụn trong mụi trƣờng cú cỏc dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Cỏc đoạn DNA mới đƣợc tạo thành lại đƣợc sử dụng làm khuụn. Sau nhiều chu kỳ, số lƣợng đoạn DNA khuụn đƣợc nhõn lờn hàng triệu bản, nhờ vậy cú thể cú đủ số lƣợng phục vụ cho những mục đớch nghiờn cứu tiếp theo. Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:
Giai đoạn biến tớnh: DNA mạch kộp ban đầu tỏch làm 2 mạch đơn nhờ nhiệt độ cao.
Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thớch hợp, hai mồi sẽ tự bỏm vào 2 đầu của đoạn DNA đớch theo nguyờn tắc bổ sung.
Giai đoạn kộo dài chuỗi nhờ enzyme DNA polymerase: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng đƣợc tăng lờn khoảng 720C là nhiệt độ thớch hợp cho Taq DNA polymerase hoạt động đoạn mồi tổng hợp DNA mới bổ sung với sợi DNA đớch. PCR đƣợc thực hiện trong tổng thể tớch 25μl bao gồm cỏc thành phần: Thành phần phản ứng Thể tớch H2O (nuclease free) x μl Byffer (-Mg++) 2,5μl dNTPs 0,2μl MgCl2 (25mM) 2,0μl Primer F(10pM) 1,0μl
Primer R(10pM) 1,0μl Taq DNA polymerase (10u/ml) 0,1μl Template 1,0μl Tổng 25àl Phản ứng đƣợc thực hiện trờn mỏy PCR - 100TM
với chu trỡnh nhiệt: 940C trong 4 phỳt, 30 chu kỳ (940
C: 1 phỳt; 520C: 1 phỳt; 720C: 1 phỳt 20 giõy), kộo dài 10 phỳt ở 720C, sau đú giữ ở 40
C.
Phản ứng PCR cũn nhiều chu kỳ kế tiếp. Trong phản ứng này cú rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng và tớnh đặc hiệu của sản phẩm. Chỳng tụi đó tiến hành khảo sỏt một số thành phần và điều kiện phản ứng PCR, trong đú quan trọng nhất là hai yếu tố nồng độ Mg2+
và nhiệt độ gắn mồi.
Chỳ ý: Khi tiến hành phản ứng PCR cỏc bước tiến hành và cỏc hoỏ chất phải được giữ trong đỏ lạnh để đảm bảo hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất.
Sau khi tiến hành xong phản ứng PCR, sản phẩm sẽ được điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%.
2.4.3.6. Phương phỏp phõn tớch đa hỡnh đoạn cắt giới hạn (RFLP)
Nguyờn tắc
Enzyme giới hạn (RE - Restriction Enzymes) là nhúm enzyme endonuclease cắt phõn tử DNA mạch kộp ở những vị trớ (trỡnh tự) xỏc định mà chỳng cú khả năng nhận ra. Thuộc tớnh rất quan trọng này của enzyme cho phộp cắt phõn tử DNA ở cỏc vị trớ tồn tại sẵn.
Mỗi enzyme giới hạn hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng thớch hợp nhƣ: nhiệt độ, dung dịch cú chứa cỏc ion kim loại và pH nhất định. Nờn tiến hành trong một thể tớch càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xỳc giữa enzyme và cơ chất. Tuy nhiờn, phải đảm bảo cho thể tớch
RE khụng quỏ 1/10 thể tớch phản ứng vỡ RE đƣợc bảo quản trong dung dịch đệm chứa 50% glyceryl (glyceryl cú tỏc dụng ức chế hoạt động của enzyme).
Cỏc đoạn DNA nhất định khỏc nhau về trỡnh tự nucleotide sẽ đƣợc cỏc enzyme giới hạn nhận biết tại cỏc vị trớ khỏc nhau phự hợp với vị trớ cắt của enzyme đú. Sự khỏc biệt về trỡnh tự nucleotide giữa cỏc đối tƣợng nghiờn cứu sẽ dẫn đến việc thờm vào hay bớt đi cỏc vị trớ của enzyme giới hạn. Do đú sẽ tạo ra cỏc đoạn đa hỡnh cú kớch thƣớc khỏc nhau và cỏc đoạn DNA đặc trƣng này sẽ bị phỏt hiện trờn cỏc bản điện di. Dựa vào sự khỏc nhau của cỏc đoạn DNA mà cú thể dựng để xỏc định kiểu gen của cỏc mẫu nghiờn cứu.
Phƣơng phỏp này đƣợc dựng để xỏc định đa hỡnh gen di truyền, phõn loại, xỏc định cỏc điểm đột biến. Cỏc enzyme giới hạn cú thể phỏt hiện cỏc đột biến đặc hiệu trong gen do sự thay đổi trỡnh tự nucleotide, thụng qua đú giỳp chỳng ta xỏc định đƣợc cỏc allen trong kiểu gen của cỏ thể. Phõn biệt cỏc allen trội lặn, kiểu gen dị hợp tử hay đồng hợp tử.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR Thành phần H-FABP/HaeIII (àl)