3. í nghĩa của đề tài
2.4.3.3. Phương phỏp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose
DNA sau khi đƣợc tỏch chiết, sản phẩm phản ứng PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn sẽ đƣợc kiểm tra bằng phƣơng phỏp chạy điện di.
Nguyờn tắc
Ở pH trung tớnh, DNA tớch điện õm nhờ cỏc nhúm phosphate nằm trờn khung phosphodieste của cỏc acid nucleic, nờn khi chạy trong điện trƣờng cú điện thế và cƣờng độ thớch hợp, chỳng sẽ chuyển từ cực õm sang cực dƣơng của điện trƣờng. Khi chạy điện di trờn giỏ thể là gel agarose tuỳ thuộc vào kớch thƣớc và độ dài đoạn DNA mà chỳng sẽ phõn tỏch thành cỏc băng khỏc nhau trờn bản gel điện di. Phõn tử cú kớch thƣớc lớn sẽ dịch chuyển chậm hơn phõn tử cú kớch thƣớc nhỏ.
Loại gel phổ biến nhất là agarose, agarose đƣợc chiết suất từ tảo biển, nú bị núng chảy trong dung dịch đệm ở nồng độ thớch hợp, thƣờng khoảng 0,3-2,0% (w/v), khi làm nguội, agarose đụng lại thành gel, đƣợc dựng làm khuụn tra mẫu trong điện di.
Nồng độ gel phụ thuộc vào kớch thƣớc trung bỡnh của cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch. Đoạn DNA cú kớch thƣớc càng nhỏ đũi hỏi hàm lƣợng agarose trong gel càng lớn và ngƣợc lại. Bảng 2.2 dƣới đõy cho thấy mối tƣơng quan giữa nồng độ agarose và độ lớn của cỏc phõn tử DNA cần phõn tớch.
Bảng 2.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gel agarose và kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tớch theo Sambrook và cs (1998)[60] Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tớch (kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 Tiến hành
Chuẩn bị agarose với nồng độ thớch hợp để kiểm tra cỏc sản phẩm. Agarose đƣợc hoà tan trong đệm TBE 1x, đun cho tan chảy trong lũ vi súng. Để nguội trong khoảng 40-500C, rút gel vào khay điện di đó cài sẵn lƣợc, độ dày gel 3-5mm, để khoảng 30 phỳt cho gel đụng lại, rỳt lƣợc ra. Đặt gel vào buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1x ngập mặt bản gel 0,5-1cm.
Lấy 10àl DNA trộn với 2àl Loading dye (cú chức năng kộo mẫu xuống đỏy giếng và chặn khụng cho mẫu chạy khỏi bản điện di). Sau đú tra mẫu vào cỏc giếng cựng với chỉ thị DNA (100bp) để ƣớc lƣợng kớch thƣớc phõn tử DNA và chạy điện di với hiệu điện thế là 100V.
Khi kết thỳc điện di, bản gel sẽ đƣợc nhuộm bằng Ethedium bromide 1% (EtBr cú khả năng liờn kết với cỏc base của nucleotide và phỏt huỳnh quang dƣới tỏc dụng của tia tử ngoại) Khoảng 15-20phỳt, rửa nhẹ bằng nƣớc cất, cỏc băng DNA sẽ đƣợc quan sỏt và chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng của tia tử ngoại (254nm). Quan sỏt và chụp ảnh gel bằng hệ thống chụp ảnh tự động.