3. í nghĩa của đề tài
1.1.7.2.Chỉ thị di truyền (Gentic marker)
Chỉ thị di truyền phõn tử (gentic marker) là một hay một trỡnh tự DNA đó đƣợc xỏc định vị trớ trờn nhiễm sắc thể, và cú tƣơng quan với một số gen hoặc một tớnh trạng cụ thể. Nú đƣợc biết nhƣ một biến dị đƣợc sinh ra do đột biến hoặc do sự biến đổi vị trớ trong hệ gen. Một chỉ thị di truyền cú thể là một trỡnh tự DNA ngắn nhƣ trỡnh tự lặp lại xung quanh một base - pair hoặc một đoạn dài nhƣ minisatellites.[68]
Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng cỏc phƣơng phỏp chọn lọc dựa trờn khoa học về di truyền quần thể và khoa học thống kờ đó cho phộp tạo ra vật
nuụi cú hiệu suất tăng trƣởng cao. Cỏc kết quả dựa trờn chọn lọc kiểu hỡnh với một số tớnh trạng kinh tế quan trọng ở gia sỳc, gia cầm đó đạt đƣợc nhiều thành tựu đỏng kể. Tuy nhiờn, theo thời gian những hạn chế của phƣơng phỏp này trong việc cải thiện tớnh di truyền vật nuụi đó trở nờn rừ ràng. Hiệu quả của chỳng giảm khi cỏc tớnh trạng mong muốn khú định lƣợng, khả năng di truyền thấp (vớ dụ: tớnh khỏng bệnh). Thờm vào đú, việc chọn lọc núi chung chỉ hạn chế vào cỏc đặc tớnh cú thể đo lƣờng một cỏch phự hợp ở một số lƣợng lớn cỏc mẫu. Một vài đặc tớnh nhƣ: Tỷ lệ sống sút, năng suất trứng... lại biểu hiện rất muộn trong quỏ trỡnh sống nờn khú cú thể dựng để làm tiờu chớ cú ớch trong chọn lọc. Ngoài ra hiệu quả chọn lọc dựa trờn kiểu hỡnh thƣờng khụng cao khi mục tiờu chọn lọc cú tƣơng quan di truyền khụng phự hợp (vớ dụ: năng suất sữa và hàm lƣợng protein của sữa), sự tƣơng tỏc giữa cỏc gen trong cựng một locus hay cỏc locus khỏc nhau (hiện tƣợng ỏt gen) và giữa cỏc gen với mụi trƣờng cũng rất phức tạp, do đú khú cú thể xỏc định một cỏch chớnh xỏc nếu chỉ dựa trờn thụng tin về kiểu hỡnh và phả hệ. [45]
Sự phỏt triển của kỹ thuật sinh học phõn tử đó mở ra khả năng xỏc định và sử dụng cỏc biến dị hệ gen cho việc nõng cao tớnh di truyền của giống vật nuụi. Đặc biệt sự ra đời của cỏc chỉ thị di truyền (cỏc trỡnh tự đỏnh dấu trong bộ gen liờn kết với cỏc tớnh trạng cần quan tõm) cú thể giỳp giải quyết những hạn chế của phƣơng phỏp trờn.
Việc sử dụng cỏc thành phần của kiểu gen, cỏc chỉ thị di truyền cho phộp bỏ qua cỏc biến động khụng di truyền đồng thời theo dừi đƣợc cỏc biến động di truyền khụng biểu hiện ra kiểu hỡnh, xỏc định sớm cỏc tớnh trạng, do vậy rỳt ngắn đƣợc thời gian chọn lọc. Hơn nữa, phƣơng phỏp này đi vào xỏc định trực tiếp trờn vật liệu di truyền nờn kết quả chọn lọc nhanh và chớnh xỏc hơn so với dựa vào ngoại hỡnh [58]
Hệ thống cỏc chỉ thị phõn tử chớnh của động vật cú thể kể đến: RFLP, RAPD, AFLP, Microsatellites... Trong nghiờn cứu, cỏc chỉ thị này đƣợc sử dụng vào rất nhiều mục đớch:
* Dựng để đỏnh giỏ mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuụi. Nếu mức biến động di truyền này cũn cao thỡ cần tiếp tục quỏ trỡnh chọn lọc nhằm ổn định dũng.
* Cho phộp đỏnh giỏ sự khỏc biệt di truyền giữa hai cỏ thể bố mẹ. Sự khỏc biệt này càng lớn thỡ tớnh dị hợp tử ở thế hệ con càng cao.
* Theo dừi hiệu quả của một chƣơng trỡnh chọn giống định hƣớng đối với một allen đặc biệt.
* Xỏc định cỏc chỉ thị ở cỏc locus cú liờn kết chặt chẽ với cỏc tớnh trạng mong muốn.
Dựa trờn cỏc chức năng, ngƣời ta chia chỉ thị di truyền làm 2 loại cơ bản nhƣ sau:
* Chỉ thị loại 1 (known function)
Cũn gọi là cỏc ứng cử gen (candidate gen) - là những chỉ thị đối với những gen đó biết chớnh xỏc sản phẩm biểu hiện, do vậy đƣợc coi là quyết định tới cỏc tớnh trạng mong muốn [58]. Những chỉ thị này đƣợc phỏt hiện nhờ kỹ thuật RFLP, SNP chủ yếu là cỏc chỉ thị đối với cỏc gen nằm trong vựng mó hoỏ (coding gen).
Vớ dụ: Đột biến gen RYR - 1 ở vị trớ 1843 (do việc thay thế base C bằng T) cú liờn quan đến bệnh tăng thõn nhiệt ỏc tớnh (malignant hyperthermia).
*Chỉ thị loại 2 (unknown function)
Là những chỉ thị nằm ngoài vựng mó hoỏ của gen, nú cú thể nằm gần hoặc cỏch xa đoạn gen đó biết sản phẩm biểu hiện. Chỉ thị loại này chƣa đƣợc biết sản phẩm của nú, song đƣợc xỏc định là cú tỏc động hoặc ảnh hƣởng đến
tớnh trạng [58]. Chỉ thị DNA này thƣờng đƣợc phỏt hiện nhờ kỹ thuật RAPD, AFLP, Microsatellites, Minisatellite...
Trong nghiờn cứu và phõn tớch di truyền cỏc giống vật nuụi, mỗi loại chỉ thị phõn tử cú thế mạnh riờng và đem lại hiệu quả nhất định. Do vậy, việc lựa chọn và sử dụng chỉ thị phõn tử nào phự hợp cũn tuỳ thuộc vào mục đớch nghiờn cứu cũng nhƣ điều kiện về cơ sở vật chất và cỏc trang thiết bị thớ nghiệm.
1.1.7.3. Ứng dụng cỏc chỉ thị di truyền đến cỏc tớnh trạng số lượng ở lợn
Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia sỳc khỏc, thƣờng cỏc chỉ thị di truyền đƣợc sử dụng cú liờn quan đến cỏc tớnh trạng năng suất, chất lƣợng thịt, sức sống cao, khả năng khỏng bệnh... Đú là cỏc tớnh trạng số lƣợng (quantiative trait) hay cũn gọi là cỏc tớnh trạng liờn tục (vỡ trong quần thể giỏ trị của cỏc tớnh trạng này biến thiờn liờn tục) và vị trớ di truyền tƣơng ứng của chỳng đƣợc gọi là cỏc vị trớ tớnh trạng số lƣợng (QTL - Quantiative trait loci).
Hiện nay, việc sử dụng cỏc chỉ thị di truyền để phỏt hiện những vựng trong bộ gen liờn quan đến cỏc tớnh trạng số lƣợng đƣợc ứng dụng rộng rói, đặc biệt chỳng đƣợc sử dụng vào việc xỏc định dấu vết di truyền, hỡnh thành cỏc bản đồ liờn kết (linkage map) hay bản đồ khu trỳ tớnh trạng số lƣợng (QTL mapping) với vị trớ cỏc gen mó hoỏ cho những tớnh trạng mong muốn, nhằm đỏp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọc và phục vụ cho những chiến lƣợc lai tạo và chọn giống theo phƣơng phỏp cổ điển.
Phỏt triển cỏc chỉ thị di truyền phõn tử nhỡn chung đều đũi hỏi trỡnh độ kỹ thuật cao song cú nhiều ƣu điểm nhƣ: cho phộp sử dụng nguồn gen mà khụng làm ảnh hƣởng đến sự điều hoà, biểu hiện tự nhiờn của gen, chỉ với lƣợng mẫu chứa vật liệu di truyền ớt vẫn cho kết quả nhanh và chớnh xỏc. Do vậy mà thời gian qua, số lƣợng gen và chỉ thị di truyền trờn bản đồ di truyền lợn liờn tục đƣợc phỏt triển. Nhiều chỉ thị di truyền liờn quan đến tớnh trạng cú
ý nghĩa kinh tế đó đem lại hiệu quả to lớn trong điều khiển năng suất giống vật nuụi này.
1.1.7.4. Gen Heart-fatty acid binding protein (H-FABP)
1.1.7.4.1. Vị trớ, cấu trỳc, chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mó hoỏ cho protein gắn acid bộo ở cơ, nằm trờn
nhiễm sắc thể số 6 ở lợn, tại vị trớ 6q21 → 6q26 [40], tƣơng ứng vị trớ gen H- FABP ở ngƣời là 1p32→1p33, ở chuột nằm trờn nhiễm sắc thể số 4. Đú là vựng cú tớnh bảo thủ cao trong quỏ trỡnh tiến hoỏ. Khi tiến hành nghiờn cứu bản đồ liờn kết của 7 microsatellites trờn nhiễm sắc thể số 6, Ovilo đó xỏc định đƣợc gen H-FABP nằm trong khoảng giữa marker SW316 và SO228 (SW316 - 3,4cM - H-FABP - 12,5cM - SO228)[52,53].
Hỡnh 1.2. Vị trớ gen mó hoỏ H-FABP trờn nhiễm sắc thể số 6 ở lợn
Cấu trỳc gen H-FABP gồm: 4 exon mó hoỏ lần lƣợt cho cỏc đoạn polipeptide gồm 24, 58, 34, 17 acid amine và 3 intron cú kớch thƣớc khoảng 4,2; 2,5; 1,5 kb [40].
Phõn tớch trỡnh tự vựng điều khiển 5' của gen H-FABP chứa cỏc TATA-Box nằm phớa trƣớc mó khởi đầu (ATG) 92 bp và cú chứa nhiều vị trớ liờn kết tiềm năng tƣơng ứng với cỏc yếu tố phiờn mó khỏc nhau, cỏc thụ thể của cỏc hormone.
Bảng 1.1: Vị trớ của cỏc yếu tố phiờn mó bỏm trờn vựng phớa trƣớc đầu 5' của gen mó hoỏ H-FABP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yếu tố Trỡnh tự tƣơng ứng Vị trớ
Yếu tố hoạt hoỏ Protein 1 (AP-1) STGACTMA -875 Yếu tố hoạt hoỏ protein 2 (AP-2) CCSCRGGC -408
Yếu tố hoạt hoỏ protein 3 (AP-3) TGTGWWW -1545,-714
CCAAT-EBP (C/EBP) TKNNGYAAK
-1608, -1504, -1072, -665, - 628 E-Box CANNTG -1539, -1328, -1308, -1111, -768, -110
Growth Hormone (GH-cse 2) AATAAAT -1441
Glucocorticoids (GRE) TGTTCT -1000
Krox-24 GCGSGGGCG -134
Yếu tố hoạt hoỏ tuyến vỳ (MAF) GRRGSAAGK -1134
Sat-5 TTCNNNGAA -1178
Những yếu tố này phự hợp với những bỏo cỏo về sự biểu hiện đặc hiệu
cỏc H-FABP. E-Box cú chức năng điều khiển biểu hiện cỏc H-FABP đặc hiệu
trong tế bào cơ xƣơng nhờ sự liờn kết với họ protein MYOD của cơ. Cơ chế chung điều khiển H-FABP cú thể giải thớch bằng sự cú mặt của cỏc vị trớ liờn kết tiềm năng tƣơng ứng nhƣ yếu tố hoạt hoỏ protein (activator protein - AP 1, 2, 3), Krox 24 và cỏc yếu tố đỏp ứng glucocorticoids. Một đoạn 13 nucleotide (CTTCCT[A/C]TTTCGG) tỡm thấy ở vị trớ nucleotide - 250 ở lợn là một nhõn tố mới trong điều khiển phiờn mó khi so sỏnh với trỡnh tự trờn genbank/EMBL. Yếu tố liờn kết tiềm năng Stat - 5 giải thớch cho sự phụ thuộc của quỏ trỡnh tiết sữa với sự biểu hiện của gen H-FABP. Vị trớ liờn kết Stat - 5 cũng đƣợc phỏt hiện trong cỏc promotor của cỏc gen mó hoỏ protein sữa.
Chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mó hoỏ cho một protein H-FABP liờn kết acid bộo
ở cơ, cú kớch thƣớc là 15 kDa. H-FABP là một thành viờn thuộc nhúm protein liờn kết lipid nằm trong tế bào, chỳng bao gồm 9 loại F-ABP khỏc nhau nằm ở cỏc mụ đặc hiệu khỏc nhau của cơ thể. Đú là A-FABP nằm ở mụ mỡ, B-FABP
ở cỏc tế bào thần kinh của nóo, E-FABP ở biểu bỡ, H-FABP ở tế bào cơ, I- FABP ở ruột, IL- FABP ở hồi tràng, L-FABP ở gan, M-FABP ở myelin và T- FABP nằm ở tinh hoàn [36].
Hỡnh 1.3: Trỡnh tự aminoacid của cỏc loại F-ABP
H- FABP thƣờng cú mặt ở cỏc mụ cú nhu cầu cao vờ cỏc acid bộo là mụ
cơ hay cỏc mụ cơ tim, mụ cơ xƣơng và tuyến sữa. Nguồn gốc của chất ức chế sinh trƣởng trong vỳ là một protein ức chế sự phỏt triển của cỏc tế bào u, thực chất là hỗn hợp của H-FABP và một loại A-FABP.
H-FABP là cỏc protein nhỏ nội bào liờn kết với cỏc acid bộo để vận chuyển cỏc acid bộo này qua màng tế bào chất đến vị trớ β-oxy hoỏ cỏc acid bộo để cung cấp năng lƣợng hoặc tổng hợp triacylglycerol (TAG) hay phospholipid [66]. Hơn thế nữa, H-FABP cú thể điều chỉnh hàm lƣợng acid bộo trong cơ và thụng qua con đƣờng này chỳng điều khiển quỏ trỡnh tổng hợp lipid. H-FABP và A-FABP đƣợc coi là hai ứng cử gen cho tớnh trạng hàm lƣợng mỡ ở lợn.
Hỡnh 1.4: Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào
1.1.7.4.2. Đa hỡnh di truyền gen H-FABP
Tớnh trạng chất lƣợng thịt gồm một tập hợp cỏc tớnh trạng đƣợc điều khiển bởi nhiều gen. Cỏc tớnh trạng này bao gồm cỏc thành phần của cơ (hàm lƣợng mỡ cơ, tỷ lệ cũng nhƣ độ dày của thịt nạc, hàm lƣợng cholesterol) và cỏc chỉ tiờu chất lƣợng (độ pH, màu sắc, khả năng giữ nƣớc hay mất nƣớc, độ mềm ngon khi chế biến). Hàm lƣợng mỡ giắt trong cơ (intramuscular fat
content - IMF) là lƣợng mỡ đƣợc phõn bố trong thịt nạc. Hàm lƣợng mỡ cơ ảnh hƣởng đến lƣợng nƣớc, độ mềm và vị ngon của thịt lợn.
Chất lƣợng thịt lợn bị ảnh hƣởng bởi hai yếu tố di truyền và dinh dƣỡng. Để nghiờn cứu đồng tỏc dụng của hai loại yếu tố đú, Li C.L., Sa X.Y., Meng H., Pan Y.C. (2009)[48], thực hiện thử nghiệm này trờn 136 lợn lai với khoảng 65 kg trọng lƣợng, chia thành 4 nhúm, mỗi nhúm đƣợc cho ăn với khẩu phần khỏc nhau. Sau 35 ngày nuụi, lợn thịt khoảng 95kg trọng lƣợng cơ thể và chất lƣợng thịt đƣợc đỏnh giỏ. Đa hỡnh gen H-FABP đƣợc phõn tớch. Cỏc kết quả thu đƣợc nhƣ sau: (1) nguồn thức ăn cú tỏc dụng rất lớn đến màu thịt (MC), pH24, chất bộo trong cơ (IMF,%) và protein trong cơ bắp (IMP,%); (2) đa hỡnh
gen H-FABP ảnh hƣởng đến IMF (%) và IMP (%); (3) sự tƣơng tỏc giữa gen
và thành phần thức ăn cú tỏc dụng đỏng kể đến pH và IMF (%)[48].
Gen H-FABP nằm trờn nhiễm sắc thể số 6, chỳng đƣợc giải trỡnh tự và
cú 3 vị trớ cắt của enzyme giới hạn. Ba vị trớ đa hỡnh độ dài đoạn giới hạn đó đƣợc xỏc định trờn trỡnh tự gen H-FABP: điểm cắt của enzyme HinfI tại nucleotide 1324 nằm ở phớa trƣớc đầu 5' của gen H-FABP (T bị thay thế bằng C), điểm cắt của enzyme MspI tại nucleotide 1489 (T bị thay thế bằng C), điểm cắt của enzyme HaeIII tại nucleotide 1811 (G bị thay thế bằng C), cả hai điểm cắt của enzyme MspI và HaeIII nằm trờn intron của gen H-FABP[40]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
FABPs là một họ cỏc protein nhỏ cú khả năng liờn kết và vận chuyển
cỏc acid bộo đến cỏc vị trớ mà ở đú cỏc acid bộo đƣợc sử dụng. H-FABP đƣợc coi là ứng cử gen cho hàm lƣợng mỡ cơ liờn quan đến độ dày mỡ lƣng ở lợn. Gerben và cs [41], bằng cỏch sử dụng 3 vị trớ đa hỡnh ở gen H-FABP của lợn đó phỏt hiện ra mối liờn quan giữa kiểu gen mó hoỏ cho H-FABP với IMF (hàm lƣợng mỡ giắt trong cơ) và BF (hàm lƣợng mỡ lƣng). Nghiờn cứu này cho thấy lợn cú kiểu gen H-FABP là aaddHH cú hàm lƣợng IMF cao nhất. Kết quả nghiờn cứu cho thấy đa hỡnh RFLP gen H-FABP cú liờn quan đến hàm lƣợng IMF cũng nhƣ hàm lƣợng BF.
Ảnh hƣởng của đa hỡnh gen H-FABP với sự tăng hàm lƣợng IMF cú thể là do sự khỏc biệt trong vận chuyển cỏc acid bộo của cỏc protein H-FABP. Sự khỏc biệt của cỏc allen tăng sự tớch luỹ mỡ trong cơ bằng cỏch tăng hiệu quả tớch luỹ của cỏc acid bộo trong mụ cơ xƣơng và điều khiển vận chuyển cỏc acid bộo nội bào khỏc nhau. Ngƣợc lại, gen H-FABP tỏc động làm tăng lƣợng mỡ lƣng một cỏch giỏn tiếp, bởi vỡ cỏc mụ mỡ dƣới da khụng biểu hiện H-FABP, nhƣng cú mặt của A-FABP. Do H-FABP khụng đƣợc tiết ra bởi cỏc tế bào cơ cho nờn chỳng khụng tƣơng tỏc trực tiếp với cỏc mụ mỡ dƣới da. Bờn cạnh ảnh hƣởng khụng trực tiếp của H-FABP lờn độ dày mỡ lƣng, thỡ ảnh hƣởng của H- FABP lờn IMF cũng gúp phần giải thớch sự biến đổi của độ dày mỡ lƣng. Đó cú những bằng chứng cho thấy ảnh hƣởng của đa hỡnh gen H-FABP liờn quan đến tốc độ phỏt triển của lợn. Túm lại, H-FABP ảnh hƣởng đến hàm lƣợng IMF, độ dày mỡ lƣng và tốc độ sinh trƣởng của quần thể lợn.[41]
Ảnh hƣởng hàm lƣợng mừ ơ cơ với đa hỡnh gen mó hoỏ H-FABP cũng đƣợc nghiờn cứu ở lợn: Landrace, Large White, và một số giống lợn nội Trung Quốc: Neijiang, Rongchang, Hanjiang đen, Hanzhong trắng, Banmei... thỡ kiểu gen H-FABP cú tƣơng quan với hàm lƣợng mỡ cơ. Dựa trờn phƣơng phỏp đa hỡnh đoạn cắt giới hạn, kết quả nghiờn cứu cho thấy cú sự khỏc nhau về cỏc tớnh trạng hàm lƣợng mỡ trong thịt giữa cỏc nhúm kiểu gen lần lƣợt là: AA<Aa<aa; HH>Hh>hh và DD<Dd<dd. Hiệu suất di truyền tƣơng ứng là: 2,28<2,7<2,95; 3,89>3,42>3,17; 2,27<2,49<2,91[54]. Những nghiờn cứu trờn lợn Cinta Senese cũng cho thấy đa hỡnh H-FABP liờn quan đến hàm lƣợng mỡ trong cơ [38]. Ở lợn Calabrese đó chứng minh là lợn mang kiểu gen mó hoỏ
H-FABP là AaddHh cú hàm lƣợng mỡ lƣng cao hơn lợn mang kiểu gen
aaddHH; lợn cú kiểu gen Aaddhh cú độ dày mỡ lƣng dày hơn lợn mang kiểu gen AaddHh, lợn mang kiểu gen HH cú màu sắc thịt sỏng hơn so với kiểu gen khỏc. Nguyễn Thu Thuý đó nghiờn cứu trờn 5 giống lợn bản địa Việt Nam là:
Cỏ, Mẹo, Múng Cỏi, Mƣờng Khƣơng và Tạp Nỏ [25]; Tạ Thị Thoa (2009) đó tiến hành nghiờn cứu đa hỡnh ở lợn Múng Cỏi và lợn Landrace. Cỏc kết quả