3. í nghĩa của đề tài
2.4.3.4. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
Nguyờn tắc:
Dựa trờn sự hấp thụ ỏnh sỏng tia tử ngoại ở bƣớc súng 260nm của cỏc base purine và pirimidine mà ngƣời ta cú thể định lƣợng DNA trong dung dịch.
Giỏ trị mật độ quang ở bƣớc súng 260nm (OD260: Optical Density) của cỏc mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lƣợng DNA cú mặt trong dung dịch, cho phộp xỏc định nồng độ DNA trong mẫu.
Nồng độ của DNA đƣợc tớnh theo cụng thức sau:
CDNA(àg/ml) = OD260 x 50(àg/ml) x Độ pha loóng.
Trong đú: 1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA = 50(àg/ml)
Độ pha loóng là độ pha loóng mẫu trong quỏ trỡnh đo.
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, ngƣời ta đo thờm giỏ trị OD ở bƣớc súng 280nm (OD280). 280nm là bƣớc súng ở đú cỏc protein cú mức hấp thụ cao nhất nhƣng cỏc protein cũng hấp thụ ỏnh sỏng ở bƣớc súng 260nm nhƣ cỏc acid nucleic và do đú làm sai lệch giỏ trị thật của nồng độ của acid nucleic.
Độ tinh sạch của DNA đƣợc tớnh bằng tỷ số bƣớc súng 260nm/280nm. Một dung dịch nucleic đƣợc xem là sạch, khụng tạp nhiễm RNA và protein khi tỷ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [3].
Tiến hành
Đối chứng 1ml TE 1x
Mẫu 5àl mẫu DNA + 495 àl TE 1x
- Cuvette đối chứng: Lấy 1 ml TE 1x cho vào 1 cuvette để làm đối chứng. - Cuvette đo mẫu:
+ Lấy 5 àl dung dịch DNA (50àg/ml) cần định lƣợng hoà tan trong 495àl TE 1x (pha loóng 100 lần). Sau đú đo OD ở bƣớc súng 260nm và 280nm.
Từ cỏc giỏ trị OD thu đƣợc ở 2 bƣớc súng, cú thể tớnh nồng độ và độ tinh sạch của DNA theo cụng thức trờn.