3. í nghĩa của đề tài
2.4.3.2. Phương phỏp tỏch chiết DNA từ mẫu mụ tai lợn
Hỡnh 2.1: Sơ đồ quy trỡnh thớ nghiệm
Nguyờn tắc
Phƣơng phỏp tỏch chiết DNA dựa trờn cỏc tớnh chất lý hoỏ học đặc trƣng của DNA và sự khỏc biệt so với cỏc hợp chất hữu cơ khỏc nhƣ protein, lipid, RNA... trong tế bào để loại bỏ cỏc tạp chất ra khỏi mẫu bằng cỏc hoỏ chất, cỏc đặc điểm vật lý khỏc nhau.
Xỏc định kiểu gen của H-FABP
Khuyếch đại gen H-FABP bằng phƣơng phỏp PCR với cặp mồi đặc hiệu
Thu mẫu mụ tai (n = 80)
Tỏch chiết và tinh sạch DNA hệ gen từ mẫu mụ tai lợn
Xỏc định nồng độ và tinh sạch DNA bằng quang phổ kế, điện di trờn Gel agarose 1%
Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn đoạn gen H- FABP với HaeIII
Tiến hành
Bƣớc 1: Phỏ vỡ màng tế bào và nhõn
Sử dụng khoảng 20mg/mẫu mụ tai lợn (đƣợc lấy ra từ ống bảo quản bằng cồn 700
, trong -200C), để khụ cồn trong khụng khớ ở nhiệt độ phũng. Nghiền mẫu thành dạng bột mịn trong nitơ lỏng, đảm bảo cho cỏc tế bào tỏch rời nhau tạo điều kiện hoạt động cho cỏc hoỏ chất, đồng thời nhờ hoạt động cơ học phỏ vỡ màng tế bào.
Bổ sung 500àl đệm phỏ tế bào cú tỏc dụng phỏ vỡ màng tế bào và màng nhõn, giải phúng DNA ra ngoài mụi trƣờng. Trong thành phần của đệm phỏ màng cú chứa SDS và EDTA khụng chỉ giỳp phỏ màng tế bào mà cũn cú khả năng ức chế hoạt động của nuclease, đảm bảo cho DNA khụng bị phõn huỷ trong quỏ trỡnh tỏch chiết.
Bƣớc 2: Loại bỏ cỏc thành phần khụng cú bản chất DNA
Thờm 2,5àl protease K (20mg/ml) sau đú ủ trong thời gian từ 8-10 tiếng ở 560C. Sử dụng protease K để cắt protein nằm trong nội bào hay liờn kết với DNA.
Bổ sung 2àl RNase (100mg/ml) trong thời gian 1 tiếng ở 370
C, RNase để cắt cỏc RNA.
Bổ sung 500àl CH3COONH4 7,5M trong thời gian 2 tiếng ở -200C, cỏc muối amoni cú tỏc dụng kết tủa cỏc protein và cỏc thành phần khỏc trong dung dịch. Ly tõm 13.000 rpm/phỳt, trong 30 phỳt ở 40C, để lắng cỏc phần kết tủa xuống dƣới đỏy. Thu dung dịch nổi và loại bỏ cạn. (Thực hiện 2 lần).
Bƣớc 3: Tủa DNA
Bổ sung ethanol tuyệt đối vào tủa DNA theo tỷ lệ 2:1 để trong thời gian 2 tiếng ở -200C. Sau đú ly tõm với tốc độ 13.000 rpm/phỳt trong 30 phỳt ở 40C. Thu tủa.
Rửa tủa bằng 500 àl ethanol 700, ly tõm với tốc độ 13.000 rpm/phỳt, trong 30 phỳt ở 40C, thu tủa. Để khụ cồn trong khụng khớ ở nhiệt độ phũng. (Thực hiện 2 lần). Hoà tan tủa bằng 100àl TE và bảo quản ở 40
C.