3. í nghĩa của đề tài
2.4.3.6. Phương phỏp phõn tớch đa hỡnh đoạn cắt giới hạn (RFLP)
Nguyờn tắc
Enzyme giới hạn (RE - Restriction Enzymes) là nhúm enzyme endonuclease cắt phõn tử DNA mạch kộp ở những vị trớ (trỡnh tự) xỏc định mà chỳng cú khả năng nhận ra. Thuộc tớnh rất quan trọng này của enzyme cho phộp cắt phõn tử DNA ở cỏc vị trớ tồn tại sẵn.
Mỗi enzyme giới hạn hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng thớch hợp nhƣ: nhiệt độ, dung dịch cú chứa cỏc ion kim loại và pH nhất định. Nờn tiến hành trong một thể tớch càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xỳc giữa enzyme và cơ chất. Tuy nhiờn, phải đảm bảo cho thể tớch
RE khụng quỏ 1/10 thể tớch phản ứng vỡ RE đƣợc bảo quản trong dung dịch đệm chứa 50% glyceryl (glyceryl cú tỏc dụng ức chế hoạt động của enzyme).
Cỏc đoạn DNA nhất định khỏc nhau về trỡnh tự nucleotide sẽ đƣợc cỏc enzyme giới hạn nhận biết tại cỏc vị trớ khỏc nhau phự hợp với vị trớ cắt của enzyme đú. Sự khỏc biệt về trỡnh tự nucleotide giữa cỏc đối tƣợng nghiờn cứu sẽ dẫn đến việc thờm vào hay bớt đi cỏc vị trớ của enzyme giới hạn. Do đú sẽ tạo ra cỏc đoạn đa hỡnh cú kớch thƣớc khỏc nhau và cỏc đoạn DNA đặc trƣng này sẽ bị phỏt hiện trờn cỏc bản điện di. Dựa vào sự khỏc nhau của cỏc đoạn DNA mà cú thể dựng để xỏc định kiểu gen của cỏc mẫu nghiờn cứu.
Phƣơng phỏp này đƣợc dựng để xỏc định đa hỡnh gen di truyền, phõn loại, xỏc định cỏc điểm đột biến. Cỏc enzyme giới hạn cú thể phỏt hiện cỏc đột biến đặc hiệu trong gen do sự thay đổi trỡnh tự nucleotide, thụng qua đú giỳp chỳng ta xỏc định đƣợc cỏc allen trong kiểu gen của cỏ thể. Phõn biệt cỏc allen trội lặn, kiểu gen dị hợp tử hay đồng hợp tử.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR Thành phần H-FABP/HaeIII (àl)
H2O khử ion 1,5
Dung dịch đệm 2,5
Sản phẩm PCR 15
Enzyme giới hạn (5u/àl) 1
Tổng thể tớch 20
* H-FABP cắt bởi enzyme HaeIII được ủ qua đờm ở nhiệt độ 370
C.