11 Nhiệt độ cơ thể 36-37 0 C (ở
2.4Xác định tên loài Nosema sp ký sinh trên sâu ăn tạp tại TP.Cần Thơ
Định danh sơ bồ loài Nosema sp. đã thu thập được bằng phương pháp ly trích
DNA và so sánh mối quan hệ dựa vào sự di truyền. Số mẫu được dùng để phân tích là 16 mẫu, ly trích DNA tại phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học, bộ môn Bảo vệ thực vật, sau đó gửi sang trường đại học Nihon Nhật Bản để định danh.
Phƣơng pháp ly trích DNA
Những thành trùng của bướm sâu ăn tạp bị nhiễm microsporidia được ly trích, tách lọc và ly tâm sạch với percoll theo quy trình của Iwano, 2008. Những bào tử Microsporidia sau khi ly tâm được trữ trong 0,85% NaCl để phục vụ cho việc định danh loài cũng như là thử hiệu lực trên sâu ăn tạp. Ly trích DNA theo quy trình của Hatakeyama, 2010 có cải tiến như sau:
Bào tử Microsporidia được rửa 2 lần với nước cất thanh trùng để loại bỏ muối NaCl
↓
Sau khi rửa với nước, lấy ra khoảng 5µl cho vào tube 1,5ml ↓
+ Cho vào thêm 200µl STE buffer (….) Ly tâm ở 3000 vòng, 1 phút, nhiệt độ phòng Sau ly tâm, thu phần trắng đọng dưới tube ↓
Tiếp tục cho vào 0,15g glass beads và 200µl STE buffer
Lắc rung mạnh với máy vortex khoảng 30 giây
Ly tâm 16,000g , 1 phút, nhiệt độ phòng Thu lấy khoảng 150µl dung dịch bên trên Còn phần trắng bên dưới cho 200µl STE buffer
Lắc rung với máy vortex khoảng 30 giây
Ly tâm 16,000g x 2 phút, nhiệt độ phòng
Thu lấy khoảng 50µl dung dịch bên trên (Tổng cộng 200µl)
Đặt dung dịch trên trong 950
C, 5 phút
Sau đó cho vào1/10V 3M CH3COONa + 2V 99.9% EtOH
Ly tâm 16000g × 10 phút
Bỏ phần dung dịch bên trên, thu phần lắng đọng dưới + Cho vào tiếp 300µl 70％ EtOH
Ly tâm 16000g ×3 phút
Hút chân không làm khô để thu DNA, cho vào DNA 50ul nước cất, Trữ ở 40C
Sau khi ly trích được DNA sử gửi sang trường Đại học Nihon để giải trình từ chuỗi rRNA của SSU