3.3.2.1. Đánh giá định tính khả năng kháng vi khuẩn
Tiến hành xác định khả năng kháng vi khuẩn B. cereus BK7 và S. aureus BK3 của các CDC nhận được. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả trong phần 7.phụ lục 1.Sau 24-48h tiến hành quan sát và đo đường kính vòng kháng khuẩn.
ạ Kết quả đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn đối với chủng B.
cereus BK7
Kết quả thí nghiệm đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn thu được thể hiện trên hình 3.5:
Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.6.
Bảng 3.5. Đường kính vòng kháng khuẩn B. cereus BK7 (mm)
Diclorometan N-hexan Ethanol
Hình 3.5. Khả năng kháng chủng B. cereus BK7của 03 loại CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng: 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm.
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi
chiết 3 4 5 6
Diclorometan 6 6,5 7,5 8
N-hexan 12,5 12,5 13,5 14,5
-53-
Nhận xét và thảo luận:
Từ kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.5 và bảng 3.5 cho thấy:
Tất cả các CDC đều có vòng kháng khuẩn so với mẫu đối chứng. Như vậy CDC từ hành tăm nhận được từ cả 3 dung môi và với các nồng độ CDC sử dụng trong nghiên cứu (0,03; 0,04; 0,05; 0,06 (mg/µl dung môi)) đều có khả năng ức chế chủng vi khuẩn B. cereus BK7. Cao n-hexan cho hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất ở tất cả hàm lượng CDC và bán kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 14,5 mm ở hàm lượng cao là 0,06 mg/µl dung môị Cao diclorometan cho hoạt tính kháng khuẩn thấp nhất và bán kính vòng kháng khuẩn bé nhất ở tất cả các hàm lượng CDC.
Hàm lượng CDC càng cao thì khả năng kháng đối với chủng B. cereus BK7 càng tăng thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần.
Từ những phân tích ở trên cho thấy cả 3 loại CDC đều có khả năng kháng chủng
B. cereus BK7 khá tốt. Đặc biệt cao n-hexan cho hoạt tính kháng tốt nhất, thể hiện
tính ưu việt của cao n-hexan và càng chứng minh cho kết quả quan sát cảm quan rằng cao n-hexan có độ tinh khiết hơn cả.
b. Kết quả đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn với chủng S. aureus
BK3
Nghiên cứu được tiếp tục tiến hành trên chủng S. aureus BK3, một chủng vi khuẩn khá nghuy hiểm, tồn tại thường trực trên hầu hết các loại thực phẩm và cơ thể con ngườị
Kết quả được thể hiện trên các hình ảnh sau:
Diclometan N-hexan Ethanol
Hình 3.6. Khả năng kháng chủng S. aureus BK3của 03 loại CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng: 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm
-54- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.6. Đường kính vòng kháng khuẩn S. aureus BK3 (mm)
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi chiết
3 4 5 6
Diclorometan 5,5 6 6,5 7
N-hexan 11 11,5 12,5 13
Ethanol 7 7,5 9,5 11,5
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy cả 3 loại CDC đều có khả năng ức chế chủng vi khuẩn S. aureus BK3.
Càng tăng hàm lượng CDC thì khả năng kháng khuẩn càng tăng thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần.
Ở cùng hàm lượng cao 0,06 mg/µl dung môi: Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất đối với cao n-hexan là 13mm cao hơn so với cao diclorometan là 6mm và cao hơn so với cao ethanol là 2,5mm.
Như vậy, CDC sử dụng dung môi n-hexan có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng S. aureus BK3 lớn nhất (số đo bán kính vòng kháng khuẩn lớn nhất) so với các CDC còn lạị CDC sử dụng dung môi diclorometan có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng S. aureus BK3 kém nhất (số đo bán kính vòng kháng khuẩn bé nhất).
Thực nghiệm kiểm định khả năng kháng vi khuẩn kiểm định cho thấy hoạt lực
của CDC nhận được bằng dung môi n-hexan cao nhất đối với tất cả 07 chủng vi khuẩn
kiểm định. Như vậy sử dụng dung môi n-hexan để chiết hành tăm cho phép thu được hoạt chất kháng khuẩn cao hơn.
3.3.2.2. Đánh giá định tính khả năng kháng nấm mốc
Tiến hành xác định khả năng kháng nấm của 3 loại CDC trên 2 chủng nấm
Aspergillus niger và Penicilium oxalicum currie and thom. CDC được pha loãng với
dung môi ethanol tới các nồng độ khác nhau 0,03 mg/µl dung môi; 0,04 mg/µl dung môi; 0,05 mg/µl dung môi; 0,06 mg/µl dung môi, dịch pha loãng được đưa vào các lỗ trên đĩa thạch và xác định theo phương pháp mô tả trong phần 7.phụ lục 1.
Sau 24-48h tiến hành quan sát và đo đường kính vòng kháng nấm.
ạ Khả năng kháng đối với chủng nấm Aspergillus niger
-55-
Diclorometan N-hexan cồn Ethanol
Hình 3.7. Khả năng kháng nấm Aspergillus niger của các CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC tương ứng: 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. (mg/µl dung môi). Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm
Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Đường kính vòng kháng nấm Aspergillus niger (mm)
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 3.7 và bảng 3.7 cho thấy:
Cả 3 loại CDC đều có khả năng ức chế chủng nấm mốc Aspergillus niger. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Càng tăng hàm lượng CDC thì khả năng kháng nấm mốc càng tăng, thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng nấm tăng dần: đối với cao n-hexan đường kính vòng kháng tăng từ 5,5mm (ở hàm lượng cao 0,03 mg/µl dung môi) lên tới 9,5mm (ở hàm lượng cao 0,06 mg/µl dung môi).
Cao n-hexan có hoạt tính kháng nấm đối với chủng Aspergillus niger lớn nhất (bán kính vòng kháng khuẩn lớn nhất) so với các CDC còn lại: tiêu biểu là ở hàm lượng cao 0,06 mg/µl dung môi đường kính vòng kháng của cao n-hexan lớn nhất (9,5mm) cao hơn so với đường kính vòng kháng của cao ethanol 0,5mm và cao hơn đường kính vòng kháng của cao diclorometan là 2,5mm trong cùng điều kiện.
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi
3 4 5 6
Diclorometan 5,5 6 6,5 7
N-hexan 5,5 6 7,5 9,5
-56-
CDC sử dụng dung môi diclorometan có hoạt tính kháng nấm kém nhất (bán kính vòng kháng khuẩn bé nhất).
b. Khả năng kháng đối với chủng Penicilium oxalicum currie and thom
Kết quả thể hiện trên hình 3.8.
Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.8.
Bảng 3.8. Đường kính vòng kháng nấm Penicilium oxalicum currie and tom (mm)
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 3.8 và bảng 3.8 cho thấy:
Cả 3 loại CDC đều có khả năng ức chế chủng nấm mốc Penicilium oxalicum
currie and thom.
Càng tăng hàm lượng CDC thì khả năng kháng nấm mốc càng tăng, thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng nấm tăng dần.
Diclorometan N-hexan Ethanol
Hình 3.8. Khả năng kháng nấm Penicilium oxalicum currie and thom của các CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm.
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi chiết
3 4 5 6
Diclorometan 5,5 7 7,5 8
N-hexan 7 85 9 9,5
-57-
Cao n-hexan có hoạt tính kháng nấm đối với chủng Penicilium oxalicum currie
and thom lớn nhất (bán kính vòng kháng khuẩn lớn nhất). Ở hàm lượng cao là 0,06
mg/µl dung môi bán kính vòng kháng khuẩn của cao n-hexan là 9,5 mm, cao diclorometan và cao ethanol là 8mm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cả 2 loại cao diclorometan và cao ethanol đều có hoạt tính kháng nấm đối với chủng Penicilium oxalicum currie and thom và khả năng kháng gần như là bằng nhau (bán kính vòng kháng khuẩn tương đương nhau) trong hầu hết các hàm lượng CDC.
Kết quả nhận được trong các nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của CDC nhận được bằng các dung môi khác nhau cho thấy tất cả các phương pháp tách chiết sử dụng đều có khả năng tách chiết các hoạt chất sinh học kháng các chủng vi khuẩn và vi nấm kiểm định. Hoạt lực kháng vi sinh vật kiểm định của CDC nhận được bằng dung môi n-hexan cao nhất đối với tất cả 07 chủng vi khuẩn và 02 chủng nấm mốc kiểm định.
Tất cả các kết quả nhận được trong những nghiên cứu trên cho thấy tinh dầu nhận được bằng phương pháp chưng cất theo hơi nước có tỉ lệ thu hồi rất thấp 0,18%, thời gian tách chiết khá dài 20h. Trong khi đó tách chiết bằng phương pháp Soxhlet tỷ
lệ thu hồi cao lớn hơn rất nhiều: 0,73% đối với cao ethanol, 0,35% đối với cao n-
hexan, và 0,63% đối với cao diclorometan, thời gian chiết rút lại ngắn (10h) và thể hiện rõ hoạt tính kháng vi sinh vật hơn. Do vậy đề tài lựa chọn phương pháp tách chiết Soxhlet với các dung môi cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.3.3. Đánh giá định lượng khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn
Trong các thí nghiệm này, cần chuẩn bị các mẫu vi sinh vật đưa vào xác định khả năng kháng vi khuẩn có cùng mật độ tế bào thông qua giá trị độ hấp thụ quang học (OD) và mật độ tế bàọ Các chủng vi khuẩn thực nghiệm sau khi hoạt hóa 2 lần, rồi tiến hành đo chỉ số OD và đếm số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu theo phương pháp được mô tả ở phần 7. phụ lục 1.
-58-
Bảng 3.9. Chỉ số OD của các dịch vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên OD trung bình (A)
1 Salmonella BK1 0,896 2 Ẹ coli BK2 0,865 3 S. aureus BK3 0,886 4 Pseudomonas BK4 0,812 5 B. subtilis BK5 0,817 6 Ẹ coli BK6 0,898 7 B. cereus BK7 0,865
Bảng 3.10. Mật độ tế bào của các dịch vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên Số lượng tế bào /1 ô Mật độ tế bào (x 107 tế
bào /ml) 1 Salmonella BK1 32 8 2 Ẹ coli BK2 25 6,25 3 S. aureus BK3 30 7,5 4 Pseudomonas BK4 25 6,25 5 B. subtilis BK5 23 5,75 6 Ẹ coli BK6 26 6,5 7 B. cereus BK7 25 6,25
Từ kết quả thu được ở các bảng trên cho thấy:
Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn kiểm định sau khi được pha loãng có giá trị tương đối đồng đềụ Điều này sẽ tạo điều kiện tốt cho quá trình nghiên cứu so sánh tính kháng khuẩn của các loại CDC đối với các chủng vi khuẩn trên.
Do Cao diclorometan cho hoạt tính kháng khuẩn kém hơn 2 loại cao còn lại nên trong thí nghiệm này sẽ chỉ sử dụng 2 loại cao n-hexan và cao ethanol.
Tiến hành xác định hoạt tính kháng của cao ethanol và n-hexan đối với 7 chủng vi khuẩn theo phương pháp được mô tả ở phần 8. phụ lục 1.
* Thử nghiệm đối với cao ethanol: Kết quả nhận được thể hiện trên hình 3.9. * Thử nghiệm đối với cao n-hexan: Kết quả nhận được thể hiện trên hình 3.10.
-59-
Hình 3.9. Khả năng kháng khuẩn của cao ethanol
- ĐC: đối chứng. Lỗ số 1; 2; 3; 4 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng 0,03; 0,04; 0,05; 0,06.
- 1/1, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 6/1, 7/1: tương ứng với các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
-60-
Hình 3.10. Khả năng kháng khuẩn của cao n-hexan
- ĐC: đối chứng. Lỗ số 1; 2; 3; 4 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. - 1/2, 2/2, 3/2, 4/2, 5/2, 6/2, 7/2: tương ứng với các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
-61-
Kết quả đo đường kính vòngkháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.11 và bảng 3.12.
Bảng 3.11. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao ethanol (mm) Nồng độ của dịch chiết (x 10-2mg/ml) STT Chủng VK 3 4 5 6 1 SalmonellạBK1 7 8 9 9 2 ẸcolịBK2 5,5 7 7,5 7,5 3 S.aureus.BK3 6 6.5 7 7 4 Pseudomonat.BK4 5 5,5 6 6,5 5 B.subtilis.BK5 6,5 7 7,5 8,5 6 ẸcolịBK6 8 8,5 9 9,5 7 B.cereus.BK7 8 8,5 9 9
Bảng 3.12. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao n-hexan (mm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ của dịch chiết (x 10-2 mg/µl) STT Chủng vi khuẩn 3 4 5 6 1 Salmonella BK1 6,5 7 7,5 8 2 Ẹ coli BK2 6,5 7,5 8 8,5 3 S. aureus BK3 8 8,5 10 10,5 4 Pseudomonas BK4 7,5 8 9 10 5 B. subtilis BK5 7 8,5 9 9,5 6 Ẹ coli BK6 7,5 8 9 10 7 B. cereus BK7 8 9 10,5 11 Nhận xét và thảo luận:
Nghiên cứu thể hiện trên các hình 3.9, hình 3.10 và các bảng 3.11, bảng 3.12 cho thấy CDC nhận được từ cả hai dung môi ethanol và n-hexan đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển đối với cả 7 chủng vi khuẩn kiểm định và khả năng ức chế càng lớn khi tăng hàm lượng CDC lên.
Trong cùng điều kiện hàm lượng CDC và hàm lượng vi khuẩn cho vào môi trường, hoạt tính kháng khuẩn của cao n-hexan lớn hơn hẳn cao ethanol (đường kính các vòng tròn kháng khuẩn lớn hơn) trong hầu hết các hàm lượng cao cho vàọ
-62-
Cao ethanol: ức chế tốt nhất đối với chủng B. cereus BK7 và Ẹ coli BK6 (số đo đường kính vòng kháng lớn nhất) và kém nhất đối với chủng Pseudomonas BK4 (số đo đường kính vòng kháng bé nhất). Đối với cao n-hexan: ức chế tốt nhất với B.
cereus BK7và S. aureus BK3 và kém nhất với chủng Salmonella BK1.
Từ các phân tích trên cho thấy cao n-hexan cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn rõ rệt so với cao ethanol. Chính vì vậy, đề tài lựa chọn hướng tách chiết Soxhlet sử dụng dung môi n-hexan để thu được CDC có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt nhất.
3.3.4. Xác định liều lượng nhỏ nhất của cao dịch chiết có khả năng kháng vi khuẩn (MIC) khuẩn (MIC)
3.3.4.1. Xác định MIC của cao dịch chiết kháng vi khuẩn B. cereus BK7
Vi khuẩn B. cereus BK7 thường có mặt ở hầu hết các loại thực phẩm tươi sống hoặc đã qua chế biến. Vì vậyvi khuẩn B. cereus BK7 được lựa chọn để xác định với liều lượng nhỏ nhất của dịch chiết mà ở đó vi khuẩn B. cereus BK7sẽbị ức chế.
Nghiên cứu được tiến hành với dịch chiết của cả 03 dung môi theo phương pháp được mô tả ở phần 7. phụ lục 1. Kết quả nhận được thể hiện trong hình 3.11 và bảng 3.13.
Ethanol N-hexan Diclorometan
Hình 3.11. Xác định MIC với vi khuẩn B. cereus BK7
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 0,25; 0,5; 1; 2; 3 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng 0,0025; 0,005; 0,01; 0,02; 0,03. Đường kính các lỗ đục 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm.
Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.13.
Bảng 3.13. Đường kính vòng kháng khuẩn của 3 loại CDC với B. cereus BK7
-63- Nồng độ của dịch chiết (x 10-2 mg/µl) Dung môi 0,25 0,5 1 2 3 Ethanol 5 5,25 6 8 N-hexan 5,25 6 8,5 12 Diclorometan 5 5,1 5,25 5,5 Nhận xét và thảo luận:
Nghiên cứu thể hiện trên hình 3.11 và bảng 3.13 cho thấy giá trị MIC đối với chủng vi khuẩn B. cereus BK7 lớn nhất là cao diclorometan (mức 0,01 mg/µl dung môi với đường kính vòng kháng khuẩn 5,1mm), thấp hơn là cao ethanol (mức 0,005 mg/µl dung môi với đường kính vòng kháng khuẩn 5,25mm), cuối cùng giá trị MIC nhỏ nhất là cao n-hexan (mức 0,0025 mg/µl dung môi với đường kính vòng kháng 5,25mm).
Kết quả phân tích trên phù hợp với kết quả thử kháng vi sinh vật ở các phần nghiên cứu trên cho thấy cao n-hexan có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt nhât.
-64-
Salmonella BK1 Ẹ coli BK2
Pseudomonas BK4 S. aureus BK3
Hình 3.12. Xác định MIC của cao ethanol với 5 chủng vi khuẩn
- ĐC:đối chứng. Lỗ số 1; 2; 3; 4 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng 0,005; 0,01; 0,02; 0,03
- 1/1, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1 trên các hình vẽ: tương ứng với các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5.
B. subtilis BK5
-65-
Bảng 3.14. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao ethanol với vi khuẩn (mm) (MIC) Nồng độ của dịch chiết (x 10-2 mg/µl) Chủng vi khuẩn 0,5 1 2 3 Salmonella BK1 4,5 5 5,5 6 Ẹ coli BK2 4,5 4,5 5 5,5 S. aureus BK3 4,5 4,5 5 6 Pseudomonas BK4 4,5 4,5 4,5 5 B. subtilis BK5 5 5,5 6 6.5 Nhận xét và thảo luận:
Từ các nghiên cứu thể hiện trên hình 3.12 và bảng 3.14 cho thấy:
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});