(Anabiosis = dạng sống ngầm = sống tiềm sinh)
Theo nguyên tắc này người ta áp dụng những biện pháp nhằm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật và hạn chế các hoạt tính của các Enzyme nhưng không giết chết hoặc đình chỉ hoàn toàn. Thuộc nguyên tắc này có 5 biện pháp thường được sử dụng:
ạ Bảo quản lạnh
Phương pháp này còn được gọi là “Lưu giữ thực phẩm ở trạng thái lạnh hay đông lạnh”nhiệt độ < O0C.
Ở nhiệt độ thấp sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tạm ngừng, hoạt động của các Enzyme bị đình chỉ, các quá trình sinh hoá trong thực phẩm bị ức chế; nhưng nếu đem khối nguyên liệu trở về nhiệt độ thường thì mọi hoạt động có thể được hồi
-30-
phục, bỡi lẽ vi sinh vật không bị giết chết (nhất là nấm mốc), nó chỉ giữ ở trạng thái tiềm sinh mà thôị
b. Bảo quản thực phẩm bằng cách phơi hay sấy khô
Phần lớn vi khuẩn chỉ sinh trưởng và phát triển được trong điều kiện tối thiểu là 30%; nấm mốc thì đòi hỏi môi trường có độ ẩm tối thiểu là 15%. Khi đem phơi hay sấy khô thực phẩm, tức là làm cho độ ẩm của nguyên liệu nhỏ hơn độ ẩm tối thiểu, khiến cho các vi sinh vật gây nhiễm không thể phát triển được.
c. Bảo quản thực phẩm bằng cách tạo áp suất thẩm thấu cao
Khi môi trường bên ngoài có áp suất thẩm thấu cao hơn bên trong tế bào vi sinh vật sẽ xảy ra hiện tượng “co nguyên sinh”có nghĩa là nước trong tế bào vi sinh vật bị rút ra ngoài, nguyên sinh chất bị đông đặc rồi tách khỏi màng tế bào dần dần chết.
Để tạo áp suất thẩm thấu cao cho môi trường cần chú ý chọn những tác nhân không gây độc, bỡi vì phải sử dụng một nồng độ khá cao mới đủ ngưỡng bảo quản. Thường thường người ta dùng muối ăn (NaCl) và đường kính (Saccharose).
- Muối ăn NaCl có tính chất sát trùng nhẹ, hạn chế sự hoà tan Oxy vào môi trường, do vậy kìm hãm hoạt động của bọn vi sinh vật hiếu khí. Riêng ion Cl- còn có khả năng ức chế Enzyme Proteasẹ
- Dùng đường Saccharose cũng có tác dụng tương tự như muối ăn. Khi dùng đường để làm các loại mứt hoặc tẩm ướp các loại thực phẩm.
d. Bảo quản thực phẩm bằng acid
Đa số các loại vi sinh vật gây nhiễm cho thực phẩm đều hoạt động tốt ở khoảng pH trên 4,5, khi pH hạ xuống dưới ngưỡng này chúng ngừng phát triển. Ngâm thực phẩm vào acid tức là tạo ra xung quanh khối nguyên liệu một môi trường có pH thấp dưới 4,5.
Loại acid thường dùng nhất là acid acetic CH3COOH. Ở nồng độ từ 6 – 10% acid này được gọi là giấm ăn.
ẹ Bảo quản thực phẩm bằng khí trơ và khí Cacbonic
Mục đích ngăn cách khối nguyên liệu với không khí, bằng cách dùng một khối lượng khí trơ N2 được hoá lỏng ở -1270C.
Cũng có thể dùng một biện pháp thứ hai là điều chỉnh tỷ lệ của bầu không khí trong kho chứa thực phẩm bằng cách giảm thấp lượng O2 và tăng lượng CO2. Khi hạ tỷ lệ O2/CO2 đã cùng lúc tạo ra hai hiệu quả.
-31-
Lên men là quá trình chuyển hoá các nguyên liệu dạng glucid thành rượu và acid hữu cơ nhờ hoạt động của một số vi sinh vật đặc chủng. Nếu sản phẩm rượu hoặc acid hữu cơ hình thành là những chất không độc và có hương vị thơm, ngon hợp với sở thích của con người thì chúng được gọi là “những quá trình lên men có lợi”.
Như vậy, các tài liệu tham khảo trên chủ yếu nghiên cứu về các tách chiết các hoạt chất từ thực vật nói chung, và từ củ hành hương nói riêng. Chưa có nghiên cứu về tách chiết và sử dụng các chất có hoạt tính sinh học từ củ hành tăm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và chống oxi hóa của CDC từ củ hành tăm”để bổ sung thêm về một số hoạt tính sinh học của các chất chiết từ củ hành tăm, phục vụ cho y học, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và đời sống con ngườị
-32-
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu
Củ hành tăm thu mua tại tỉnh Nghệ An, chọn lựa những củ tươi, tròn đều và có đường kính trung bình là 1-2 cm tiến hành thí nghiệm.
Hình 2.1. Hành tăm nguyên liệu
2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định: được cung cấp từ Viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Bách Khoa Hà Nộị
Bảng 2.1: Tên các chủng vi sinh vật và nấm STT Tên Nguồn gốc 1 Salmonella BK1 2 Ẹ coli BK2 3 S. aureus BK3 4 Pseudomonas BK4 5 B. subtilis BK5 6 Ẹ coli BK6 7 B. cereus BK7 8 Aspergillus.BK8 9 Penicillium.BK9
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa
-33-
2.1.3. Hóa chất sử dụng
- Các hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh vật:
Agar (Việt Nam), Cao thịt (Đức), Peptone (Đức), các loại muối vi lượng khác.
- Các dung môi tách chiết:
+ Diclorometan: diclorometan hay metylen clorua là một hợp chất hóa học với
công thức CH2Cl2. Đây là một chất lỏng không màu, dễ bay hơi với mùi thơm nhẹ. Nó được sử dụng rộng rãi làm dung môi, vì là một trong những clocacbon ít độc nhất, và nó có thể trộn lẫn với hầu hết các dung môi hữu cơ. Dung môi phân cực yếụ
Do viện Công nghệ Sinh học Đại học Bách khoa cung cấp, hóa chất Merck - Đức.
+ Ethanol: Dung môi ethanol C2H5OH còn gọi là rượu etylic là một chất lỏng không màu trong suốt, dễ bay hơi (sôi ở nhiệt độ 78,390C), tan trong nước vô hạn, tan trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu xanh da trờị Dung môi phân cực
Do viện Công nghệ Sinh học Đại học Bách khoa cung cấp, hóa chất Merck - Đức.
+ N-hexan: Dung môi n-hexan C6H14 nhiệt độ sôi 690C. N-hexan làm dung môi ly trích dầu thực vật. Chúng giúp thu hẹp phạm vi chưng cất từ dầu trích, với hàm lượng chất thơm thấp giúp loại bỏ hàm lượng các chất màu thơm không cần thiết. Do vậy chúng được dùng làm dung môi trích ly của nhiều loại dầu thực vật như: dầu đậu nành, dầu dừa, dầu đậu phụng, dầu cọ và dầu lanh… Dung môi không phân cực.
Do viện Công nghệ Sinh học Đại học Bách khoa cung cấp, (Merck - Đức).
- DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl): hóa chất dùng để xác định tính chống oxi hóa của CDC.
- Các môi trường:
Bảng 2.2. Môi trường LB hoạt hóa vi khuẩn
Hóa chất g/l Pepton 10 Cao thịt 5 Glucoza 5 NaCl 2 Nước cất 1lit
-34- PH = 7
Bảng 2.3. Môi trường MPA nuôi cấy vi sinh vật
Hóa chất g/l Pepton 10 Cao thịt 5 D-Glucoza 5 NaCl 2 Agar 18 Nước cất 1lit PH = 7
Bảng 2.4. Môi trường PDA hoạt hóa và nuôi cấy nấm mốc
`Hóa chất g/l Potato extract 4 D-Glucose 20 Agar 15 Nước cất 1lit pH = 6,5 2.1.4. Thiết bị sử dụng
- Bộ chưng cất hơi nước
- Bộ trích ly dung môi (thiết bị Soxhlet, Đức)
- Cân phân tích độ chính xác 10-4g (Mettler Toledo), cân đồng hồ - Máy ổn nhiệt (Shellab, mỹ)
- Tủ cấy vô trùng
- Cân điện độ chính xác 10-2g (Mettler Toledo) - Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)
- Lò vi sóng (Elextrolux, Thụy Điển) - Tủ ấm (Fiocell, Đức)
- Pipetman các loại (Gilson, Pháp) - Tủ lạnh (IKA, Đức)
- Nồi khử trùng (Nhật Bản) - Máy đo pH (Mettler, Thụy Sỹ)
-35- - Tủ sấy thường
- Máy sắc ký khí khối phổ - Máy đo OD
- Kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu
Ngoài ra các các thí nghiệm còn sử dụng một số dụng cụ thủy tinh và các trang thiết bị khác tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nộị
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học
Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi theo tiêu chuẩn TCVN 3700-90
Xác định hiệu suất thu hồi cao:
Hành lát khô được đưa vào tiến hành tách chiết bằng các phương pháp khác nhau, lượng sản phẩm thu hồi được đem đi cân. Xác định được hiệu suất thu hồi của sản phẩm.
Hiệu suất thu hồi CDC được tính như sau:
(%) 100 ) ( m b a X − = Trong đó:
a: Khối lượng bình cầu có CDC (g)
b: Khối lượng bình cầu không có CDC (g) m: Khối lượng hành lát sấy khô (g)
2.2.2. Phương pháp đánh giá cảm quan
Đánh giá cảm quan nguyên liệu tôm tươi bảo quản bằng các loại CDC theo phương pháp cho điểm theo TCVN 3215 – 79.
2.2.3. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
- Củ hành tăm sau khi được thu mua tại tỉnh Nghệ An, được đem đi rửa sạch rồi hong khô trong bóng dâm và một phần mang đi thái lát bằng máy thái hành với độ dày 1mm, một phần được xay nhỏ với máy xay có đường kính mắt sàng 2mm.
- Hành sau khi thái được đem đi sấy ở các mức nhiệt độ 300C, 400C, 500C trong các khoảng thời gian khác nhau: 15h, 20h, 25h. Thu được các mẫu hành sử dụng trong thí nghiệm.
-36-
Hình 2.2. Hành tăm sơ chế 2.2.4. Các phương pháp tách chiết
Các mẫu hành tăm sau khi xử lý được mang đi tách chiết các hoạt chất bằng phương pháp khác nhau:
ạ Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước: cơ chế và phương pháp tiến hành được trình bày trong phần 2. phụ lục 1.
b. Tách chiết bằng phương pháp Soxhlet: cơ chế và phương pháp tiến hành được trình bày trong phần 3. phụ lục 1.
- Dung môi diclorometan: Nhiệt độ chiết 45oC, thời gian chiết 10h - Dung môi ethanol: Nhiệt độ chiết 85oC, thời gian chiết 10h - Dung môi n-hexan: Nhiệt độ chiết 75oC, thời gian chiết 10h
Các dịch chiết thu được được mang đi cô quay chân không đuổi dung môi để thu được cao dich chiết.
2.2.5. Kiểm định khả năng kháng vi sinh vật của cao dịch chiết nhận được 2.2.5.1. Nhân giống và hoạt hóa vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật sau khi được lấy từ kho lưu trữ được đem đi hoạt hóa lại trong môi trường LB và nhân giống thời gian 12h ở nhiệt độ 370C. Các bước tiến hành cụ thể được trình bày trong phần 4. phụ lục 1.
2.2.5.2. Xác định mật độ tế bào
Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trong môi trường LB ở 370C trong thời gian 12h. Trước khi thử tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ tiến hành xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng cách đo mật độ quang OD và đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầụ
-37-
2.2.5.3. Thử khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria
Các bước tiến hành cụ thể được trình bày trong phần 6. phụ lục 1.
2.2.5.4. Thử khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ
* Thử định tính * Thử định lượng
* Xác định liều lượng nhỏ nhất của CDC kháng vi sinh vật (MIC): Các bước tiến hành cụ thể được trình bày trong phần 7. phụ lục 1.
2.2.6. Xác định khả năng chống oxi hóa của cao dịch chiết
Cơ chế và các bước tiến hành được trình bàyphần 8. phụ lục 1.
2.2.7. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng bảo quản tôm của cao dịch chiết
Tôm tươi được mua từ đại lý bán hàng thủy sản, rửa sạch, sau khi để ráo nước, tôm được mang đi quết dung dịch CDC. CDC được pha loãng bằng cồn nguyên chất với các hàm lượng khác nhau 0,01g/ml; 0,02g/ml; 0,03g/ml; 0,04g/ml và được quết lên tôm ở các vị trí đã được đánh dấụ Mẫu đối chứng được quết cồn nguyên chất.
Bảo quản tôm ở nhiệt độ phòng, độ ẩm 75-85%. Theo dõi sự biến đổi của màu sắc, trạng thái và mùi, vị trong thời gian 45h, sử dụng phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn TCVN 3215–79.
2.2.8. Xác định thành phần các chất có trong cao dịch chiết
Tiến hành đối với 2 CDC cho hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất và CDC cho hoạt tính kháng khuẩn bé nhất.
Các CDC được cân khối lượng trên cân phân tích có độ nhạy 10-4,cao được pha loãng bằng chính dung môi tách chiết trong ống nhựa eppendorf với hàm lượng pha loãng mcao/mdung môi = 5mg/1ml. Sau đó được tiến hành chạy mẫu trên máy sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
-38-
2.2.9. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.9.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.2.9.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng hợp quá trình nghiên cứu được thể hiện:
Hành tăm nguyên liệu
Xử lý Thái lát, sấy khô
Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Xác định hoạt tính chống oxi hoá
Thử nghiệm khả năng bảo quản tôm của CDC
Sơ bộ xác định thành phần các chất của CDC
Nghiền nhỏ
Chưng cất lôi cuốn hơi nước Chiết soxhlet
Cô quay đuổi dung môi Làm khan
-39-
Giải thích quy trình: 1. Hành tăm nguyên liệu:
Củ hành tăm được thu mua tại tỉnh Nghệ An, bản quản nơi khô ráo thoáng mát.
2. Xử lý:
Củ hành tăm được rửa sạch lớp vỏ ngoài và bụi bẩn, hong khô trong bóng râm.
3. Thái lát, sấy khô, nghiền nhỏ:
Củ hành tăm được mang đi thái lát bằng máy thái hành độ dày 1mm; 1 phần được mang đi sấy khô với các chế độ nhiệt độ là 300C, 400C, 500C trong các khoảng thời gian 15h, 20h và 25h. Phần còn lại của hành tăm đã thái lát chưa sấy được mang đi nghiền nhỏ bằng máy nghiền có đường kính mắt sàng là 2mm.
3. Chiết Soxhlet, chưng cất lôi cuốn hơi nước:
Phần hành lát khô được tiến hành tách chiết theo phương pháp Soxhlet sử dụng 3 loại dung môi khác nhau: diclorometan, n-hexan và ethanol thu được 3 loại cao dịch chiết. Phần hành tươi nghiền nhỏ và hành lát khô nghiền nhỏ được mang đi chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được tinh dầụ
4. Cô quay đổi dung môi, làm khan:
Các cao dịch chiết được mang đi cô quay chân không tốc độ 1000v/p để đuổi dung môị Tinh dầu được mang đi làm khan bằng natri sunfat khan. Cả 2 được giữ trong lọ kín và bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theọ
5. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật:
Cả cao dịch chiết và tinh dầu thu được được mang đi thử hoạt tính kháng vi sinh vật. Sử dụng phương pháp cấy ria và phương pháp đục lỗ. Tiến hành xác định MIC đối với các loại cao dịch chiết trên một số chủng vi sinh vật đặc hiệụ
6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa:
Dung dịch DPPH được sử dụng để thử hoạt tính chống oxi hóa của các các loại cao dịch chiết. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy đo mật độ quang ở bước sóng 527nm.
7. Thử nghiệm khả năng bảo quản tôm tươi:
Các cao dịch chiết có khả năng kháng khuẩn tốt được mang đi thử nghiệm khả năng bảo quản tôm tươi trong khoảng thời gian 45h. Sự biến đổi cảm quan của tôm theo thời gian được đánh giá và cho điểm theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79.
-40-
8. Xác định thành phần các chất có trong CDC:
Cao dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất và kém nhất sẽ được chọn ra để xác định các thành phần các chất có trong cao dịch chiết. Kết quả được đọc trên máy sắc ký khí khối phổ GC-MS.
Từ sơ đồ nghiên cứu trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.
2.2.9.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu
Nguyên liệu hành sau khi sơ chế được thái lát và mang đi sấy ở các chế độ nhiệt