2.2.9.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng hợp quá trình nghiên cứu được thể hiện:
Hành tăm nguyên liệu
Xử lý Thái lát, sấy khô
Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Xác định hoạt tính chống oxi hoá
Thử nghiệm khả năng bảo quản tôm của CDC
Sơ bộ xác định thành phần các chất của CDC
Nghiền nhỏ
Chưng cất lôi cuốn hơi nước Chiết soxhlet
Cô quay đuổi dung môi Làm khan
-39-
Giải thích quy trình: 1. Hành tăm nguyên liệu:
Củ hành tăm được thu mua tại tỉnh Nghệ An, bản quản nơi khô ráo thoáng mát.
2. Xử lý:
Củ hành tăm được rửa sạch lớp vỏ ngoài và bụi bẩn, hong khô trong bóng râm.
3. Thái lát, sấy khô, nghiền nhỏ:
Củ hành tăm được mang đi thái lát bằng máy thái hành độ dày 1mm; 1 phần được mang đi sấy khô với các chế độ nhiệt độ là 300C, 400C, 500C trong các khoảng thời gian 15h, 20h và 25h. Phần còn lại của hành tăm đã thái lát chưa sấy được mang đi nghiền nhỏ bằng máy nghiền có đường kính mắt sàng là 2mm.
3. Chiết Soxhlet, chưng cất lôi cuốn hơi nước:
Phần hành lát khô được tiến hành tách chiết theo phương pháp Soxhlet sử dụng 3 loại dung môi khác nhau: diclorometan, n-hexan và ethanol thu được 3 loại cao dịch chiết. Phần hành tươi nghiền nhỏ và hành lát khô nghiền nhỏ được mang đi chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được tinh dầụ
4. Cô quay đổi dung môi, làm khan:
Các cao dịch chiết được mang đi cô quay chân không tốc độ 1000v/p để đuổi dung môị Tinh dầu được mang đi làm khan bằng natri sunfat khan. Cả 2 được giữ trong lọ kín và bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theọ
5. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật:
Cả cao dịch chiết và tinh dầu thu được được mang đi thử hoạt tính kháng vi sinh vật. Sử dụng phương pháp cấy ria và phương pháp đục lỗ. Tiến hành xác định MIC đối với các loại cao dịch chiết trên một số chủng vi sinh vật đặc hiệụ
6. Xác định hoạt tính chống oxi hóa:
Dung dịch DPPH được sử dụng để thử hoạt tính chống oxi hóa của các các loại cao dịch chiết. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy đo mật độ quang ở bước sóng 527nm.
7. Thử nghiệm khả năng bảo quản tôm tươi:
Các cao dịch chiết có khả năng kháng khuẩn tốt được mang đi thử nghiệm khả năng bảo quản tôm tươi trong khoảng thời gian 45h. Sự biến đổi cảm quan của tôm theo thời gian được đánh giá và cho điểm theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79.
-40-
8. Xác định thành phần các chất có trong CDC:
Cao dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất và kém nhất sẽ được chọn ra để xác định các thành phần các chất có trong cao dịch chiết. Kết quả được đọc trên máy sắc ký khí khối phổ GC-MS. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ sơ đồ nghiên cứu trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.
2.2.9.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu
Nguyên liệu hành sau khi sơ chế được thái lát và mang đi sấy ở các chế độ nhiệt độ 300C, 400C và 500C trong các khoảng thời gian lần lượt là 15h, 20h, 25h.
Từ quy trình trên sẽ chọn ra nhiệt độ sấy tối ưu nhất và tiếp tục tiến hành nghiên cứu phương pháp tách chiết hoạt chất sao cho vừa thu được hiệu suất tách chiết cao lại vừa đảm bảo hoạt tính của các chất thu được.
Hành tăm nguyên liệu
Xử lý
Thái lát
Xác định độ ẩm
Chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu
40oC
30oC 50oC
Sấy ở nhiệt độ khác nhau
-41-
2.2.9.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết
Hiện nay có rất nhiều phương pháp chiết rút các hợp chất trong thực vật, tuy nhiên sau khi tham khảo tài liệu thì luận văn quyết định chọn 2 phương pháp chiết lôi cuốn hơi nước và chiết Soxhlet để tiến hành nghiên cứụ Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện như saụ
Xử lý Thái lát, sấy khô (tối ưu)
Xác định hiệu xuất thu hồi
Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Chọn phương pháp tách chiết
Nghiền nhỏ
Chưng cất lôi cuốn hơi nước Chiết soxhlet
Cô quay đuổi dung môi Làm khan
CDC Tinh dầu
-42-
2.2.9.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi tách chiết
Dung môi sử dụng trong tách chiết cũng là một nhân tố rất quan trọng quyết định hiệu suất chiết rút cũng như hoạt tính của các hoạt chất sau chiết rút. Sơ đồ nghiên cứu chọn dung môi tách chiết như sau:
Hành tăm sấy (tối ưu)
Chiết soxhlet (3 dung môi)
Xác định hiệu suất thu hồi
Xác định hoạt tính sinh học Ethanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Diclometan n-hexan
Thời gian chiết 10h
-43-
2.2.9.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng vi sinh vật và chống oxi hóa của cao dịch chiết hóa của cao dịch chiết hóa của cao dịch chiết
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu trong đề tài được tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel 2003.
Hành tăm sấy (tối ưu)
Chiết Soxhlet (3 dung môi, thời gian 10h)
Xác định MIC đối với các chủng VK
Xác định khả năng chống oxi hóa Cao Ethanol
Cao Diclometan Cao n-hexan
Chọn ra loại cao có hoạt tính mạnh nhất và yếu nhất
Thử hoạt tính kháng VSV bằng phương pháp cấy ria và đục lỗ (định tính)
Thử hoạt tính kháng VSV bằng phương pháp đục lỗ
(định lượng)
Xác định thành phần các chất trong cao
Ứng dụng trong bảo quản tôm tươi
Hoạt hóa VSV (2 lần) Đo chỉ số OD
-44-
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU HÀNH TĂM
Hành tăm tươi thu mua tại Tỉnh Nghệ An, được mang đi rửa sạch rồi hong khô trong bóng râm và mang đi thái lát bằng máy thái hành có độ dày 1mm.
Sau đó tiến hành sấy hành để loại bỏ nước trong hành, nâng cao hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu tách chiết. Hành tăm được thử nghiệm sấy ở 3 khoảng nhiệt độ 300C, 400C và 500C với 3 khoảng thời gian khác nhau: 15h, 20h, 25h. Hành nhận được sau khi sấy được xác định độ ẩm.
Kết quả thể hiện trong bảng 3.21 phụ lục 2 và hình 3.1 dưới đâỵ
17.8 16.2 15.3 15 14.2 13.5 14.1 13.8 13.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
15h 20h 25hThời gian sấy
Đ ộ ẩm ( % ) 30 độ C 40 độ C 50 độ C
Hình 3.1. Độ ẩm hành tăm sau khi sấy tại các nhiệt độ khác nhau
Nhận xét và thảo luận: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả phân tích ở đồ thị trên cho thấy nhiệt độ sấy và thời gian sấy có ảnh hưởng lớn đến độ ẩm của hành khô. Càng tăng nhiệt độ sấy và thời gian sấy kéo dài thì độ ẩm càng giảm.
Ở thời gian sấy 15h, độ ẩm đạt thấp nhất khi sấy ở nhiệt độ 500C là 14,1% (nhỏ hơn ở 400C là 0,9% và nhỏ hơn ở 300C là 3,7%).
-45-
Ở thời gian sấy 20h, độ ẩm đạt thấp nhất khi sấy ở nhiệt độ 500C là 13,8% và ở 400C và 300C có giá trị tương ứng là 14,2% và 16,2%. Như vậy hàm ẩm khi sấy ở nhiệt độ 500C sẽ nhỏ hơn ở 400C là 0,4% và nhỏ hơn ở 300C là 2,4%.
Ở thời gian sấy 25h, khi sấy ở nhiệt độ 500C có hàm ẩm đạt thấp nhất (13,2%) và có giá trị nhỏ hơn ở 400C là 0,3% và nhỏ hơn ở 300C là 2,1%.
Như vậy, trong cùng một thời gian sấy, ở nhiệt độ cao hàm ẩm sẽ đạt thấp và đạt mức thấp nhất là ở nhiệt độ sấy 500C trong thời gian 25h là 13,2%.
Trong quá trình sấy, nhiệt độ tác động lên cấu trúc nguyên liệu làm cho nước trên bề mặt nguyên liệu đi ra (quá trình khuếch tán ngoại), khi tăng nhiệt độ sấy lên cao thì nước từ sâu bên trong nguyên liệu sẽ khuếch tán ra bề mặt và đi ra khỏi nguyên liệu làm cho độ ẩm nguyên liệu giảm dần (khuếch tán nội).
Khi so sánh ở thời gian sấy 20h và 25h ở 500C nhận thấy, tuy ở 25h hàm ẩm đạt thấp hơn ở 20h là 0,6 như vậy có sự chênh lệch nhưng không đáng kể. Tuy nhiên nếu sấy ở thời gian quá dài sẽ ảnh hưởng đến tính chất của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ hành tăm. Vì vậy, đề tài chọn các thông số thích hợp là sấy ở 500C trong thời gian 20h cho độ ẩm 13,8%.
Từ những phân tích ở trên cho phép chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu là sấy ở 500C
trong thời gian 20h cho độ ẩm thích hợp 13,8%.
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAO DỊCH CHIẾT TỪ CỦ HÀNH TĂM
Để nghiên cứu tách chiết cao dịch từ củ hành tăm, tiến hành một số các phương pháp như:
3.2.1. Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Hành lát tươi (200g) và hành lát khô (200g) (nhận được sau khi sấy ở nhiệt độ 50oC) được tiến hành nghiền nhỏ bằng máy nghiền có đường kính mắt sàng 2mm sau đó mang đi tách chiết lôi cuốn hơi nước theo phương pháp được mô tả trong phần 2. phụ lục 1.
Kết quả:
Sau 20h ở mẫu hành tươi, tinh dầu thu được có trọng lượng riêng lớn hơn nước nên chìm xuống dưới đáỵ Tiến hành hút tinh dầu rạ
Cân lượng tinh dầu thu được: 0,036g Tỷ lệ thu hồi tinh dầu:
-46-
Sau 20h ở mẫu hành khô vẫn không thấy xuất hiện tinh dầu, tiếp tục chiết sau thời gian 30h, kết quả vẫn không thấy xuất hiện tinh dầụ
Tiến hành thử kháng khuẩn của tinh dầu chiết từ mẫu hành tươi bằng phương pháp đục lỗ trên chủng B. cereus BK7 được mô tả cụ thể ở phần 7. phụ lục 1.
Kết quả thể hiện trên hình 3.2:
Hình 3.2. Khả năng kháng chủng B. cereus BK7 của tinh dầu
(Vị trí 1; 2; 3; 4: tương ứng với lượng tinh dầu 0,5; 1; 1,5; 2 (x 10-2 mg/µl)) Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đường kính vòng kháng khuẩn B. cereus BK7 (mm)
Vị trí đục lỗ 1 2 3 4
Hàm lượng tinh dầu (x 10-2 mg/µl)
0,5 1 1,5 2
Bán kính vòng kháng (mm) 9 10 16 19
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.2 và bảng 3.1 cho thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tinh dầu hành tăm thu nhận được bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước có hoạt tính kháng với chủng B. cereus BK7. Khi tăng lượng tinh dầu thì đường kính vòng kháng khuẩn lớn dần: cụ thể khi tăng hàm lượng tinh dầu từ 0,5 x 10-2 mg/µl lên 2x10-2 mg/µl thì bán kính vòng kháng khuẩn tăng từ 9mm lên tới 19mm, như vậy khả năng kháng khuẩn với chủng B. cereus BK7 tăng.
Từ những phân tích trên cho thấy phương pháp lôi cuốn theo hơi nước chỉ có khả năng tách được các hoạt chất có tính kháng khuẩn từ hành tăm tươị Tuy nhiên hiệu suất thu hồi tinh dầu quá bé và thời gian thu hồi quá dài (20h), nên hiệu quả tách chiết
-47-
không caọ Vì vậy, đề tài không chọn phương pháp tách chiết này cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.2.2. Tách chiết bằng phương pháp Soxhlet
Hành lát khô (300g) nhận được sau khi sấy ở các nhiệt độ 50oC được tiến hành tách chiết với các dung môi n-hexan, ethanol, diclorometan theo phương pháp được mô tả trong phần 3. phụ lục 1.CDC được cân xác định trọng lượng trên cân có độ chính xác 10-3g.
Kết quả nhận được thể hiện trên bảng 3.2:
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi CDC với các dung môi khác nhau
Dung môi tách chiết Ethanol N-hexan Diclometan
Khối lượng cao (g) 2,178 1,063 1,903 Hiệu suất thu hồi (%) 0,73 0,35 0,63
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nhận được trong bảng 3.2 cho thấy dung môi ethanol cho hiệu suất thu hồi CDC cao nhất 0,73%, còn với dung môi n-hexan hiệu suất thu hồi thấp nhất 0,35%, hiệu suất thu hồi chưa bằng một nửa so với dung môi ethanol.
Qua quan sát 3 loại CDC nhận được từ hành tăm cho thấy có sự khác nhau về màu sắc: đối với cao ethanol có màu nâu đen và keo như cao su điều này có thể dự đoán rằng cao ethanol có độ tinh khiết không cao, lẫn nhiều tạp chất và nhựạ Điều này phù hợp với tính chất của dung môi ethanol là dung môi tách chiết có tính chọn lọc thấp. Cao n-hexan có màu vàng nhạt và có độ mịn hơn, điều này có thể dự đoán rằng cao n-hexan có độ tinh khiết cao hơn, ít lẫn các chất màu chất nhựạ Do bản thân dung môi n-hexan là dung môi tách chiết có tính chọn lọc caọ Cao diclorometan có màu vàng đậm hơn và ít tươi hơn và không có độ mịn như cao n-hexan, điều này có thể dự đoán cao diclorometan có hàm lượng các chất màu cao (các flavonoid).
Từ các phân tích trên chưa thể khẳng định được CDC sử dụng dung môi nào là tốt nhất vì có thể cao ethanol có hiệu suất thu hồi cao nhưng chưa hẳn khả năng kháng khuẩn của cao đó là tốt nhất. Tiếp tục thử khả năng kháng khuẩn của các CDC để đưa ra kết luận.
-48-
3.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÁC CAO DỊCH CHIẾT DỊCH CHIẾT
3.3.1. Xác định bằng phương pháp cấy ria
Phương pháp cấy ria cho phép nhận biết khả năng kháng vi sinh vật của CDC từ củ hành tăm, trên cở sở đó đề tài tiến hành các nghiên cứu sau:
3.3.1.1. Xác định khả năng kháng vi khuẩn
Xác định định tính khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn với CDC hành tăm tách chiết bằng dung môi n-hexan. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong phần 6.phụ lục 1.
Kết quả thể hiện khả năng kháng vi khuẩn trong bảng 3.3 và hình 3.3 sau đâỵ
Không CDC Không CDC
-49-
CDC 1 mg/ml CDC 1 mg/ml
CDC 1,5 mg/ml CDC 1,5 mg/ml
Hình 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao n-hexan
Trong đó: 1: Salmonella BK1 2: Ẹ coli BK2 3: S. aureus BK3 4: Pseudomonas BK4 5: B. subtilis BK5 6: Ẹ coli BK6 7: B. cereus BK7
Giả sử đề tài sử dụng các ký hiệu sau để biểu diễn khả năng phát triển của vi khuẩn:
Kí hiệu
+++: phát triển tốt -+: phát triển yếu ++: phát triển --+: phát triển rất yếu +: phát triển bình thường ---: không phát triển Rút ra bảng kết quả sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-50-
Bảng 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao n-hexan
Hàm lượng CDC trong môi trường MPA (mg/ml)
STT Chủng vi khuẩn 0 0,5 1 1,5 1 Salmonella BK1 +++ +++ --+ --- 2 Ẹ coli BK2 +++ + + --+ 3 S. aureus BK3 +++ ++ -+ --+ 4 Pseudomonas BK4 +++ ++ -+ --+ 5 B. subtilis BK5 +++ ++ + --+ 6 Ẹ coli BK6 +++ ++ + --+ 7 B. cereus BK7 +++ + -+ --- Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy:
Khi hàm lượng CDC là 0,5 mg/ml chưa thể hiện rõ khả năng ức chế vi khuẩn, chỉ làm giảm quá trình phát triển đối với các chủng vi khuẩn so với đối chứng, không có khả năng ức chế salmonella BK1.
Khi tăng hàm lượng CDC lên 1 mg/ml thì ức chế khá mạnh đối với chủng
salmonella BK1 còn đối với chủng S. aureus BK3, Pseudomonas BK4 và B. cereus
BK7 thì sự ức chế kém hơn, còn các chủng Ẹ coli BK2, B. subtilis BK5 và Ẹ coli
BK6vẫn phát triển bình thường.
Đến khi tăng hàm lượng CDC lên 1,5 mg/ml thì các chủng salmonella BK1 và
B. cereus BK7 bị ức chế hoàn toàn và ức chế khá mạnh ở các chủng Ẹ coli BK2,
S. aureus BK3, Pseudomonas BK4, B. subtilis BK5 và Ẹ coli BK6.
Từ kết quả trên có thể nhận định, khi có mặt CDC từ hành tăm có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, hàm lượng CDC 0,5 mg/ml chưa đủ