Các số liệu trong đề tài được tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel 2003.
Hành tăm sấy (tối ưu)
Chiết Soxhlet (3 dung môi, thời gian 10h)
Xác định MIC đối với các chủng VK
Xác định khả năng chống oxi hóa Cao Ethanol
Cao Diclometan Cao n-hexan
Chọn ra loại cao có hoạt tính mạnh nhất và yếu nhất
Thử hoạt tính kháng VSV bằng phương pháp cấy ria và đục lỗ (định tính)
Thử hoạt tính kháng VSV bằng phương pháp đục lỗ
(định lượng)
Xác định thành phần các chất trong cao
Ứng dụng trong bảo quản tôm tươi
Hoạt hóa VSV (2 lần) Đo chỉ số OD
-44-
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU HÀNH TĂM
Hành tăm tươi thu mua tại Tỉnh Nghệ An, được mang đi rửa sạch rồi hong khô trong bóng râm và mang đi thái lát bằng máy thái hành có độ dày 1mm.
Sau đó tiến hành sấy hành để loại bỏ nước trong hành, nâng cao hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu tách chiết. Hành tăm được thử nghiệm sấy ở 3 khoảng nhiệt độ 300C, 400C và 500C với 3 khoảng thời gian khác nhau: 15h, 20h, 25h. Hành nhận được sau khi sấy được xác định độ ẩm.
Kết quả thể hiện trong bảng 3.21 phụ lục 2 và hình 3.1 dưới đâỵ
17.8 16.2 15.3 15 14.2 13.5 14.1 13.8 13.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
15h 20h 25hThời gian sấy
Đ ộ ẩm ( % ) 30 độ C 40 độ C 50 độ C
Hình 3.1. Độ ẩm hành tăm sau khi sấy tại các nhiệt độ khác nhau
Nhận xét và thảo luận:
Từ kết quả phân tích ở đồ thị trên cho thấy nhiệt độ sấy và thời gian sấy có ảnh hưởng lớn đến độ ẩm của hành khô. Càng tăng nhiệt độ sấy và thời gian sấy kéo dài thì độ ẩm càng giảm.
Ở thời gian sấy 15h, độ ẩm đạt thấp nhất khi sấy ở nhiệt độ 500C là 14,1% (nhỏ hơn ở 400C là 0,9% và nhỏ hơn ở 300C là 3,7%).
-45-
Ở thời gian sấy 20h, độ ẩm đạt thấp nhất khi sấy ở nhiệt độ 500C là 13,8% và ở 400C và 300C có giá trị tương ứng là 14,2% và 16,2%. Như vậy hàm ẩm khi sấy ở nhiệt độ 500C sẽ nhỏ hơn ở 400C là 0,4% và nhỏ hơn ở 300C là 2,4%.
Ở thời gian sấy 25h, khi sấy ở nhiệt độ 500C có hàm ẩm đạt thấp nhất (13,2%) và có giá trị nhỏ hơn ở 400C là 0,3% và nhỏ hơn ở 300C là 2,1%.
Như vậy, trong cùng một thời gian sấy, ở nhiệt độ cao hàm ẩm sẽ đạt thấp và đạt mức thấp nhất là ở nhiệt độ sấy 500C trong thời gian 25h là 13,2%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong quá trình sấy, nhiệt độ tác động lên cấu trúc nguyên liệu làm cho nước trên bề mặt nguyên liệu đi ra (quá trình khuếch tán ngoại), khi tăng nhiệt độ sấy lên cao thì nước từ sâu bên trong nguyên liệu sẽ khuếch tán ra bề mặt và đi ra khỏi nguyên liệu làm cho độ ẩm nguyên liệu giảm dần (khuếch tán nội).
Khi so sánh ở thời gian sấy 20h và 25h ở 500C nhận thấy, tuy ở 25h hàm ẩm đạt thấp hơn ở 20h là 0,6 như vậy có sự chênh lệch nhưng không đáng kể. Tuy nhiên nếu sấy ở thời gian quá dài sẽ ảnh hưởng đến tính chất của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ hành tăm. Vì vậy, đề tài chọn các thông số thích hợp là sấy ở 500C trong thời gian 20h cho độ ẩm 13,8%.
Từ những phân tích ở trên cho phép chọn nhiệt độ sấy nguyên liệu là sấy ở 500C
trong thời gian 20h cho độ ẩm thích hợp 13,8%.
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAO DỊCH CHIẾT TỪ CỦ HÀNH TĂM
Để nghiên cứu tách chiết cao dịch từ củ hành tăm, tiến hành một số các phương pháp như:
3.2.1. Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Hành lát tươi (200g) và hành lát khô (200g) (nhận được sau khi sấy ở nhiệt độ 50oC) được tiến hành nghiền nhỏ bằng máy nghiền có đường kính mắt sàng 2mm sau đó mang đi tách chiết lôi cuốn hơi nước theo phương pháp được mô tả trong phần 2. phụ lục 1.
Kết quả:
Sau 20h ở mẫu hành tươi, tinh dầu thu được có trọng lượng riêng lớn hơn nước nên chìm xuống dưới đáỵ Tiến hành hút tinh dầu rạ
Cân lượng tinh dầu thu được: 0,036g Tỷ lệ thu hồi tinh dầu:
-46-
Sau 20h ở mẫu hành khô vẫn không thấy xuất hiện tinh dầu, tiếp tục chiết sau thời gian 30h, kết quả vẫn không thấy xuất hiện tinh dầụ
Tiến hành thử kháng khuẩn của tinh dầu chiết từ mẫu hành tươi bằng phương pháp đục lỗ trên chủng B. cereus BK7 được mô tả cụ thể ở phần 7. phụ lục 1.
Kết quả thể hiện trên hình 3.2:
Hình 3.2. Khả năng kháng chủng B. cereus BK7 của tinh dầu
(Vị trí 1; 2; 3; 4: tương ứng với lượng tinh dầu 0,5; 1; 1,5; 2 (x 10-2 mg/µl)) Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đường kính vòng kháng khuẩn B. cereus BK7 (mm)
Vị trí đục lỗ 1 2 3 4
Hàm lượng tinh dầu (x 10-2 mg/µl)
0,5 1 1,5 2
Bán kính vòng kháng (mm) 9 10 16 19
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.2 và bảng 3.1 cho thấy:
Tinh dầu hành tăm thu nhận được bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước có hoạt tính kháng với chủng B. cereus BK7. Khi tăng lượng tinh dầu thì đường kính vòng kháng khuẩn lớn dần: cụ thể khi tăng hàm lượng tinh dầu từ 0,5 x 10-2 mg/µl lên 2x10-2 mg/µl thì bán kính vòng kháng khuẩn tăng từ 9mm lên tới 19mm, như vậy khả năng kháng khuẩn với chủng B. cereus BK7 tăng.
Từ những phân tích trên cho thấy phương pháp lôi cuốn theo hơi nước chỉ có khả năng tách được các hoạt chất có tính kháng khuẩn từ hành tăm tươị Tuy nhiên hiệu suất thu hồi tinh dầu quá bé và thời gian thu hồi quá dài (20h), nên hiệu quả tách chiết
-47-
không caọ Vì vậy, đề tài không chọn phương pháp tách chiết này cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.2.2. Tách chiết bằng phương pháp Soxhlet
Hành lát khô (300g) nhận được sau khi sấy ở các nhiệt độ 50oC được tiến hành tách chiết với các dung môi n-hexan, ethanol, diclorometan theo phương pháp được mô tả trong phần 3. phụ lục 1.CDC được cân xác định trọng lượng trên cân có độ chính xác 10-3g. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả nhận được thể hiện trên bảng 3.2:
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi CDC với các dung môi khác nhau
Dung môi tách chiết Ethanol N-hexan Diclometan
Khối lượng cao (g) 2,178 1,063 1,903 Hiệu suất thu hồi (%) 0,73 0,35 0,63
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nhận được trong bảng 3.2 cho thấy dung môi ethanol cho hiệu suất thu hồi CDC cao nhất 0,73%, còn với dung môi n-hexan hiệu suất thu hồi thấp nhất 0,35%, hiệu suất thu hồi chưa bằng một nửa so với dung môi ethanol.
Qua quan sát 3 loại CDC nhận được từ hành tăm cho thấy có sự khác nhau về màu sắc: đối với cao ethanol có màu nâu đen và keo như cao su điều này có thể dự đoán rằng cao ethanol có độ tinh khiết không cao, lẫn nhiều tạp chất và nhựạ Điều này phù hợp với tính chất của dung môi ethanol là dung môi tách chiết có tính chọn lọc thấp. Cao n-hexan có màu vàng nhạt và có độ mịn hơn, điều này có thể dự đoán rằng cao n-hexan có độ tinh khiết cao hơn, ít lẫn các chất màu chất nhựạ Do bản thân dung môi n-hexan là dung môi tách chiết có tính chọn lọc caọ Cao diclorometan có màu vàng đậm hơn và ít tươi hơn và không có độ mịn như cao n-hexan, điều này có thể dự đoán cao diclorometan có hàm lượng các chất màu cao (các flavonoid).
Từ các phân tích trên chưa thể khẳng định được CDC sử dụng dung môi nào là tốt nhất vì có thể cao ethanol có hiệu suất thu hồi cao nhưng chưa hẳn khả năng kháng khuẩn của cao đó là tốt nhất. Tiếp tục thử khả năng kháng khuẩn của các CDC để đưa ra kết luận.
-48-
3.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÁC CAO DỊCH CHIẾT DỊCH CHIẾT
3.3.1. Xác định bằng phương pháp cấy ria
Phương pháp cấy ria cho phép nhận biết khả năng kháng vi sinh vật của CDC từ củ hành tăm, trên cở sở đó đề tài tiến hành các nghiên cứu sau:
3.3.1.1. Xác định khả năng kháng vi khuẩn
Xác định định tính khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn với CDC hành tăm tách chiết bằng dung môi n-hexan. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong phần 6.phụ lục 1.
Kết quả thể hiện khả năng kháng vi khuẩn trong bảng 3.3 và hình 3.3 sau đâỵ
Không CDC Không CDC
-49-
CDC 1 mg/ml CDC 1 mg/ml
CDC 1,5 mg/ml CDC 1,5 mg/ml
Hình 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao n-hexan
Trong đó: 1: Salmonella BK1 2: Ẹ coli BK2 3: S. aureus BK3 4: Pseudomonas BK4 5: B. subtilis BK5 6: Ẹ coli BK6 7: B. cereus BK7
Giả sử đề tài sử dụng các ký hiệu sau để biểu diễn khả năng phát triển của vi khuẩn:
Kí hiệu
+++: phát triển tốt -+: phát triển yếu ++: phát triển --+: phát triển rất yếu +: phát triển bình thường ---: không phát triển Rút ra bảng kết quả sau:
-50-
Bảng 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao n-hexan
Hàm lượng CDC trong môi trường MPA (mg/ml)
STT Chủng vi khuẩn 0 0,5 1 1,5 1 Salmonella BK1 +++ +++ --+ --- 2 Ẹ coli BK2 +++ + + --+ 3 S. aureus BK3 +++ ++ -+ --+ 4 Pseudomonas BK4 +++ ++ -+ --+ 5 B. subtilis BK5 +++ ++ + --+ 6 Ẹ coli BK6 +++ ++ + --+ 7 B. cereus BK7 +++ + -+ --- Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy:
Khi hàm lượng CDC là 0,5 mg/ml chưa thể hiện rõ khả năng ức chế vi khuẩn, chỉ làm giảm quá trình phát triển đối với các chủng vi khuẩn so với đối chứng, không có khả năng ức chế salmonella BK1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi tăng hàm lượng CDC lên 1 mg/ml thì ức chế khá mạnh đối với chủng
salmonella BK1 còn đối với chủng S. aureus BK3, Pseudomonas BK4 và B. cereus
BK7 thì sự ức chế kém hơn, còn các chủng Ẹ coli BK2, B. subtilis BK5 và Ẹ coli
BK6vẫn phát triển bình thường.
Đến khi tăng hàm lượng CDC lên 1,5 mg/ml thì các chủng salmonella BK1 và
B. cereus BK7 bị ức chế hoàn toàn và ức chế khá mạnh ở các chủng Ẹ coli BK2,
S. aureus BK3, Pseudomonas BK4, B. subtilis BK5 và Ẹ coli BK6.
Từ kết quả trên có thể nhận định, khi có mặt CDC từ hành tăm có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, hàm lượng CDC 0,5 mg/ml chưa đủ
để ức chế vi khuẩn. Khi tăng hàm lượng CDC từ lên 1 mg/ml sự ức chế vi khuẩn xảy
ra rõ nét và đạt mức cao nhất ở hàm lượng CDC là 1,5 mg/ml. Như vậy, cao dịch chiết từ hành tăm không chỉ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của 1 chủng vi khuẩn giống như tinh dầu hành hương mà có khả năng ức chế hoàn toàn trên nhiều chủng vi sinh vật.
-51-
3.3.1.2. Xác định khả năng kháng nấm mốc
Xác định định tính khả năng kháng 2 chủng nấm mốc với CDC hành tăm tách chiết bằng dung môi n-hexan. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong phần 6. phụ lục 1.
Kết quả thể hiện khả năng kháng nấm mốc trong bảng 3.4 và hình 3.4 sau đây:
Không tinh dầu 1 mg/ml
Hình 3.4. Khả năng ức chế nấm mốc của cao n-hexan
Trong đó:
a: nấm Aspergillus niger d: nấm Penicilium oxalicum corrie and thom
Bảng 3.4. Khả năng kháng nấm mốc của cao n-hexan Hàm lượng CDC (mg/ml) Chủng nấm mốc
0 1
Penicilium oxalicum corrie and thom ++ -+
Aspergillus niger ++ -+
Kí hiệu
++: phát triển -+: phát triển yếu
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.4 và bảng 3.4 cho thấy:
Nấm mốc Aspergillus và Penicilium oxalicum corrie and thom niger được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CDC n-hexan (hàm lượng 1 mg/ml) đã bị ức chế sự phát triển so với mẫu đối chứng (nuôi cấy trên môi trường không có bổ sung CDC).
-52-
Như vậy, từ các phân tích trên có thể thấy được: cao n-hexan được chọn điển hình trong 3 loại cao chiết được, có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm khá tốt.
3.3.2. Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ 3.3.2.1. Đánh giá định tính khả năng kháng vi khuẩn 3.3.2.1. Đánh giá định tính khả năng kháng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành xác định khả năng kháng vi khuẩn B. cereus BK7 và S. aureus BK3 của các CDC nhận được. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả trong phần 7.phụ lục 1.Sau 24-48h tiến hành quan sát và đo đường kính vòng kháng khuẩn.
ạ Kết quả đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn đối với chủng B.
cereus BK7
Kết quả thí nghiệm đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn thu được thể hiện trên hình 3.5:
Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn được thể hiện trên bảng 3.6.
Bảng 3.5. Đường kính vòng kháng khuẩn B. cereus BK7 (mm)
Diclorometan N-hexan Ethanol
Hình 3.5. Khả năng kháng chủng B. cereus BK7của 03 loại CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng: 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm.
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi
chiết 3 4 5 6
Diclorometan 6 6,5 7,5 8
N-hexan 12,5 12,5 13,5 14,5
-53-
Nhận xét và thảo luận:
Từ kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.5 và bảng 3.5 cho thấy:
Tất cả các CDC đều có vòng kháng khuẩn so với mẫu đối chứng. Như vậy CDC từ hành tăm nhận được từ cả 3 dung môi và với các nồng độ CDC sử dụng trong nghiên cứu (0,03; 0,04; 0,05; 0,06 (mg/µl dung môi)) đều có khả năng ức chế chủng vi khuẩn B. cereus BK7. Cao n-hexan cho hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất ở tất cả hàm lượng CDC và bán kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 14,5 mm ở hàm lượng cao là 0,06 mg/µl dung môị Cao diclorometan cho hoạt tính kháng khuẩn thấp nhất và bán kính vòng kháng khuẩn bé nhất ở tất cả các hàm lượng CDC.
Hàm lượng CDC càng cao thì khả năng kháng đối với chủng B. cereus BK7 càng tăng thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần.
Từ những phân tích ở trên cho thấy cả 3 loại CDC đều có khả năng kháng chủng
B. cereus BK7 khá tốt. Đặc biệt cao n-hexan cho hoạt tính kháng tốt nhất, thể hiện
tính ưu việt của cao n-hexan và càng chứng minh cho kết quả quan sát cảm quan rằng cao n-hexan có độ tinh khiết hơn cả.
b. Kết quả đánh giá định tính khả năng kháng khuẩn với chủng S. aureus
BK3
Nghiên cứu được tiếp tục tiến hành trên chủng S. aureus BK3, một chủng vi khuẩn khá nghuy hiểm, tồn tại thường trực trên hầu hết các loại thực phẩm và cơ thể con ngườị
Kết quả được thể hiện trên các hình ảnh sau:
Diclometan N-hexan Ethanol
Hình 3.6. Khả năng kháng chủng S. aureus BK3của 03 loại CDC
ĐC: mẫu đối chứng. Lỗ số 3,4,5,6 có hàm lượng CDC (mg/µl dung môi) tương ứng: 0,03; 0,04; 0,05; 0,06. Đường kính các lỗ đục là 4mm. Đường kính vòng kháng khuẩn lỗ đối chứng 5mm
-54- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.6. Đường kính vòng kháng khuẩn S. aureus BK3 (mm)
Hàm lượng CDC (x 10-2 mg /µl dung môi)
Dung môi chiết
3 4 5 6
Diclorometan 5,5 6 6,5 7
N-hexan 11 11,5 12,5 13
Ethanol 7 7,5 9,5 11,5
Nhận xét và thảo luận:
Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy cả 3 loại CDC đều có khả năng ức chế chủng vi khuẩn S. aureus BK3.
Càng tăng hàm lượng CDC thì khả năng kháng khuẩn càng tăng thể hiện ở kích thước đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần.
Ở cùng hàm lượng cao 0,06 mg/µl dung môi: Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất đối với cao n-hexan là 13mm cao hơn so với cao diclorometan là 6mm và cao hơn