Trong các môi trường được khảo sát, môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l cho số phôi soma thu được cao nhất, kế đến là môi trường Ma*3 (không hormone). Số phôi thấp nhất trên môi trường Ma*3 với BA 0,227 mg/l (bảng 22).
Bảng 22. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trong sự phát sinh phôi (giai đoạn hình cầu) từ dịch treo tế bào có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao chuối Cau Mẵn sau 28 ngày nuôi cấy (pH 5,3; mật độ 15 l tế bào lắng/ml dịch treo tế bào).
Môi trường Số phôi / Petri
Ma*3 với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và NAA 0,2 mg/l 602,00 19,07 c MS ½ (không hormone) 520,67 25,20 d MS (không hormone) 534,67 25,09 d Ma*3 (không hormone) 720,00 23,09 b Ma*3 với BA 0,227 mg/l 156,67 12,02 e
Ma*3 với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l
826,67 27,28 a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l, phôi hình núi lửa và phôi hình kim tự tháp xuất hiện với mật độ cao hơn so với trên môi trường Ma*3 (không hormone) (hình 3.68 và 3.69). Trên môi trường Ma*3, ngoài một số phôi đạt được đến giai đoạn hình núi lửa hay hình chùy, các tế bào biểu bì của phôi ở giai đoạn hình cầu muộn có khuynh hướng phân chia quá mức dẫn đến sự hình thành các phôi thứ cấp hay mô sẹo (hình 3.70 - 3.73). Như vậy, sự thu nhận phôi soma từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn đạt số lượng cao nhất khi nuôi cấy ở mật độ tế bào 15 l tế bào lắng/ml dịch treo tế bào, trên môi trường Ma*
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l, ở pH 5,3. Tuy nhiên, sự quan sát dưới kính hiển vi cho thấy, trên các môi trường Ma*3có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l hay Ma*
3 (không hormone), các phôi không thể vượt qua giai đoạn hình kim tự tháp.
Hình 3.69. Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi t ng sinh cao trên môi trường Ma * có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2ip 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l.
ă 3
Hình 3.68.Sự phát sinh phôi sau 49 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi t ng sinh phôi trên môi trường Ma *.ă 3
500 mm
Hình 3.70 - 3.73 .
3.71. 3.72. 3.73.
hôi núi lửa hôi
hôi
P hình (quan sát dưới kính hiển vi confocal). P hình chùy (quan sát dưới kính hiển vi confocal).
P hình cầu muộn với lớp tế bào biểu bì phân chia quá mức (quan sát dưới kính hiển vi confocal)
Phôi các giai đo n phát tri n khác nhau phát tri n t t bào d ch treo có ngu n g c c m ch i tăng sinh cao chu i Cau M n trên môi trư ng Ma .
ở ạ ể ể ừ ế ị ồ ố ụ ồ ố ẵ ờ 3* 3.70 3.72 3.73 3.71 100 mm 100 mm 100 mm
3.4.5. Số lần cấy chuyền dịch treo tế bào và khả năng sinh phôi
Khả năng sinh phôi của tế bào dịch treo giảm theo số lần cấy chuyền. Số phôi thu nhận được trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l (ở pH 5,3 và mật độ tế bào ban đầu 15 l tế bào lắng/ml dịch treo tế bào), từ dịch treo tế bào của lần cấy chuyền thứ ba mươi giảm rất mạnh so với lần cấy chuyền thứ mười và hai mươi (bảng 23). Về hình thái, dịch treo tế bào của lần cấy chuyền thứ ba mươi mịn hơn (mật độ nhóm tế bào có kích thước nhỏ cao hơn) so với dịch treo tế bào của lần cấy chuyền thứ hai mươi và mười. Sau nhiều lần cấy chuyền, tế bào dịch treo có khuynh hướng giảm kích thước nhưng thể tích không bào trở nên lớn hơn.
Bảng 23. Mối liên hệ giữa số lần cấy chuyền dịch treo tế bào (có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao) và khả năng phát sinh phôi sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma*
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l.
Lần cấy chuyền dịch treo tế bào Số phôi / hộp Petri
10 826,67 27,28 a
20 810,00 26,46 a
30 530,00 25,17 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.6. Ảnh hưởng của acid abscisic trong sự trưởng thành của phôi
Sự bổ sung ABA 0,5 mg/l vào môi trường nuôi cấy giúp các phôi hình cầu có sự biểu bì hóa rõ hơn và nhanh chóng đạt đến giai đoạn núi lửa chỉ sau một tuần nuôi cấy (hình 3.74 và 3.75). Tuy nhiên, nếu tiếp tục duy trì sự nuôi cấy trên môi trường này, phôi sẽ không tiếp tục phát triển và nẩy mầm thành cây hoàn chỉnh.
Hình 3.75. Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS với ABA 0,5 mg/l. (ge),
và (ve),
phôi hình cầu phôi ở trạng thái núi lửa.
Hình 3.74.Sự phát triển phôi từ các phôi hình cầu chuối Cau Mẵn sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma * có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,02 mg/l và zeatin 0,05 mg/l. 3 150 mm 150 mm ve ge
3.4.7. Ảnh hưởng của TIBA trong sự hình thành và phát triển phôi
Ảnh hưởng của TIBA trong sự hình thành phôi
Các xử lý TIBA (chất cản sự di chuyển hữu cực của auxin) liên tục (từ ngày 0) ở các nồng độ 1,0 và 2,5 mg/l ức chế gần như hoàn toàn khả năng sinh phôi của tế bào (bảng 24, hình 3.76 - 3.78). Các xử lý vào giai đoạn tế bào đã có sự phân cực (ngày 14) ức chế rất mạnh sự sinh phôi (số phôi hình cầu sau 21 ngày xử lý giảm đáng kể). Các xử lý vào giai đoạn phôi hình cầu (ngày 28) làm giảm số phôi hình cầu và ức chế gần như hoàn toàn sự phát triển phôi, các phôi không thể đạt đến trạng thái núi lửa (bảng 24).
Bảng 24. Vai trò của TIBA trong sự phát sinh phôi sau 21 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn ở các thời điểm phát triển phôi khác nhau trên môi trường Ma*
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và TIBA ở các nồng độ thay đổi.
Nồng độ TIBA (mg/l)
Thời điểm xử lý (ngày)
Số phôi ở ngày 21
Phôi hình cầu Phôi hình núi lửa
0,0* 0 523,33 40,96 d 0,00 0,00 b 14 832,00 49,16 bc 0,00 0,00 b 28 1018,00 113,26 a 126,67 13,87 a 1,0 0 48,00 6,43 e 0,00 0,00 b 14 170,00 26,46 e 0,00 0,00 b 28 904,00 108,30 bc 5,33 1,86 b 2,5 0 0,00 0,00 e 0,00 0,00 b 14 32,00 5,29 e 0,00 0,00 b 28 813,00 67,00 c 0,00 0,00 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Hình 3.76 - 3.78.Các nhóm tế bào sau 21 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn
ở ờ ể ể ôi phát triển ờ * với
kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) trên môi tr ờng Ma * với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và TIBA 1 mg/l.
Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ờ sau khi xử ý với môi tr ờ *, không hormone).
Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ngày 14 của quá trình phát sinh phôi. Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ngày 28 của quá trình phát sinh phôi.
các th i đi m phát tri n phôi khác nhau (ph
kh i đ u
kh i đ u th i đi m kh i đ u th i đi m
trên môi trư ng Ma ư th i đi m ngày 0 (5 gi l ư ng Ma 3 3 3 3.76. 3.77. 3.78. 3.76 3.77 3.78 2mm 3mm 3mm
Ảnh hưởng của TIBA trong sự phát sinh cơ quan phôi (sự trưởng thành của phôi)
TIBA 1 mg/l ức chế hoàn toàn sự phát triển phôi khi xử lý ở giai đoạn hình cầu. Hiệu ứng ức chế giảm khi xử lý ở giai đoạn phôi hình núi lửa và kim tự tháp (bảng 25). Với xử lý ở giai đoạn phôi hình núi lửa, sự phát triển của lá bị ức chế dẫn đến sự hình thành một vòng tròn xung quanh mô phân sinh ngọn chồi (hình 3.79A). Với xử lý ở giai đoạn phôi hình kim tự tháp, đa số các phôi không có sự phát triển rễ, phần gốc phôi bị phù to ra, và lá phát triển không bình thường (hình 3.79B - 3.79D).
Bảng 25. Tác động của TIBA trên phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển
khác nhau (được thu nhận trên môi trường Ma* (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) sau 42 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l).
Nồng độ TIBA (mg/l)
Trạng thái phôi khi nuôi cấy Phôi trưởng thành (%) 0* Hình cầu muộn 5,00 2,88 c Hình núi lửa 66,67 8,82 a Hình kim tự tháp 73,33 6,67 a 1 Hình cầu muộn 0,00 0,00 c Hình núi lửa 13,33 3,33 c Hình kim tự tháp 33,33 8,82 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05 *Đối chứng: Môi trườngMS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l
Như vậy, chất cản sự di chuyển hữu cực của auxin (cản sự phân phối bình thường của auxin trong phôi) đã gây xáo trộn mạnh sự phát triển bình thường của phôi.
Hình 3.79.
(A), (B), (C),
Phôi phát triển từ phôi giai đoạn hình núi lửa sau 6 tuần nuôi cấy. kim tự tháp
8 Phôi phát triển từ phôi giai
Phôi phát triển từ phôi giai kim tự tháp
đoạn sau 6 tuần nuôi cấy. đoạn sau tuần nuôi cấy.
(D),
Sự phát triển phôi từ các phôi chuố ẵ ở ạ ể
ợ ậ ờ * với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) ờ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l.
i Cau M n các giai đo n phát tri n khác nhau (đư c thu nh n trên môi trư ng Ma
trên môi trư ng
3
MS½
Phôi với tử diệp không phát triển từphôi giai đo nạ kim tự tháp sau 8 tuần nuôi cấy.
A B
C D
500 mm 500 mm
3.4.8. Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi trong quá trình phát triển phôi
Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thay đổi tùy vào từng giai đoạn của sự phát triển phôi (bảng 26):
- Sau 5 giờ đặt tế bào dịch treo lên môi trường tạo phôi Ma*3 (không hormone), hàm lượng IAA, zeatin và ABA đều giảm mạnh (so với hàm lượng trong tế bào dịch treo, trước khi đặt trên môi trường tạo phôi).
- Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l, khi tế bào chuẩn bị phân chia trước sự phát triển phôi, IAA vẫn thấp nhưng zeatin tăng mạnh.
- Sau 21 ngày nuôi cấy, tương ứng với thời điểm một số ít phôi phát triển đến giai đoạn hình cầu sớm, IAA gia tăng trở lại nhưng zeatin giảm.
- Sau 35 ngày nuôi cấy, khi phôi phát triển đến giai đoạn hình cầu muộn (với sự thành lập vùng trung tâm mô phân sinh ngọn của phôi), IAA đạt tới đỉnh và zeatin tăng mạnh.
- Sau 56 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sungkinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l, tương ứng với thời điểm sau 14 ngày có sự hiện diện của nhiều phôi hình núi lửa, hàm lượng IAA cũng như zeatin đều giảm rất mạnh.
- ABA hiện diện ở hàm lượng rất thấp, ở dạng vết (dưới 5µg/kg), trong quá trình hình thành và phát triển phôi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ở phôi phát triển từ phôi hình núi lửa, sau 14 ngày cấy chuyền sang môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l, có sự gia tăng hàm lượng zeatin đồng thời với sự tăng nhẹ hàm lượng ABA so với phôi tăng trưởng trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l(bảng 26).
Bảng 26. Sự thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật tổng cộng trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma từ tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao (đo bằng phương pháp HPLC).
Thời điểm lấy mẫu (ngày)
Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (µg/kg)
IAA Zeatin ABA
0* <5 77,9 <5 10 <5 174,9 <5 21 57,9 56,8 <5 35 118,6 215,1 <5 56 <5 27,9 <5 56*** <5 52,1 6,33
*, thời điểm tế bào được trải lên petri (sau 5 giờ xử lý với môi trường Ma*3 không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật).
Môi trường thu nhận phôi: Ma*3 với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l. **, Phôi phát triển từ phôi hình núi lửa sau 14 ngày cấy chuyền sang trên môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l (phôi hình núi lửa được thu nhận sau 42 ngày nuôi cấy).
3.4.9. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vậttrong sự phát triển phôi
Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trong sự phát triển phôi
Trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l (với sự hiện diện của glutamin, prolin và dịch chiết lúa mạch), các phôi không thể vượt qua giai đoạn hình kim tự tháp để nẩy mầm và phát triển thành cây. Trong khi đó, trên môi trường MS và MS ½, một lượng nhỏ phôi đã nẩy mầm (lần lượt là 11,67 1,67 % và 23,33 6,00 %). Tuy nhiên, trên hai môi trường này, chỉ có phôi ở giai đoạn núi lửa mới có khả năng hoàn tất con đường phát triển phôi và nẩy mầm (bảng 27).
Từ kết quả về sự gia tăng của IAA và zeatin trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma (bảng 26), xử lý phối hợp BA 0,227 mg/l và IAA (1,0; 1,5 hay 2,0 mg/l) trong môi trường MS ½ giúp phôi hoàn tất con đường phát triển và nẩy mầm thành cây. Trong đó, sự phối hợp BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l cho số lượng phôi nẩy mầm cao nhất. Sự hiện diện của IAA (1,0; 1,5 và 2,0 mg/l) làm cho cây mầm tạo mô sẹo ở phần gốc, đặc biệt khi vật liệu sử dụng ban đầu là phôi ở giai đoạn hình cầu. Đặc biệt, môi trường MS½ với zeatin 1,0 mg/l và IAA 1,5 mg/l cũng làm tăng sự phần trăm phôi nẩy mầm, dù vật liệu sử dụng ban đầu là phôi ở giai đoạn hình cầu, núi lửa, hay kim tự tháp (bảng 27).
So sánh các giai đoạn phôi được xử lý trên môi trường với BA 0,227 mg/l hay zeatin 1,0 mg/l kết hợp với IAA 1,5 mg/l, phần trăm phôi nẩy mầm luôn rất cao khi phôi được sử dụng ở giai đoạn hình kim tự tháp hay hình núi lửa, và rất thấp ở giai đoạn phôi hình cầu (bảng 27).
Phôi ở giai đoạn hình kim tự tháp có khả năng phát triển thành cây in vitro
hoàn chỉnh về hình thái với hệ thống thân, lá và rễ (hình 3.80 và 3.81). Trong khi đó, với các phôi ở giai đoạn hình núi lửa, bên cạnh một số phôi phát triển thành cây mầm, một số có sự phát sinh chồi mới (bảng 27, hình 3.82 và 3.83). Các phôi khởi đầu ở giai đoạn hình cầu có thể phát triển thành các cây mầm với lá mầm phù to ra hay quay trở lại con đường tạo mô sẹo (bảng 27, hình 3.84 và 3.85).
Trên môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l, hệ thống mạch nhanh chóng hình thành sau 21 ngày nuôi cấy, đồng thời với sự phát triển của mô phân sinh ngọn chồi và rễ để hình thành các sơ khởi chồi và rễ sau 28 ngày nuôi cấy (hình 3.86, 3.87).
Bảng 27. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển phôi sau 42 ngày nuôi cấy các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển khác nhau (thu nhận môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l).
Môi trường Trạng thái phôi khi
bắt đầu nuôi cấy % phôi nẩy mầm
Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1mg/l, 2-iP 0,2mg/l và zeatin 0,05mg/l Cầu 0,00 0,00 e Núi lửa 0,00 0,00e Ma*3 (không hormone) Cầu 0,00 0,00e